拟南芥I型Metacaspases控制细胞死亡

拟南芥I型Metacaspases控制细胞死亡
译自Arabidopsis Type I Metacaspases Control Cell Death
Science 330,1393(2010) DOI:10.1126/science.1194980 在原生动物、真菌和植物中发现的Metacaspases是动物半胱氨酸蛋白酶的远亲。

尽管十年前它们被同源建模发现，现在只有有限的实验数据可以说明它们的功能。

我们已经证明两种I型metacaspases，AtMC1和AtMC2，在拟南芥中拮抗控制程序性细胞死亡。

AtMC1是细胞死亡的正调控因子，实现它的功能需要保守的蛋白酶类假定的催化残基。

AtMC2负调控细胞的死亡。

这项功能的实现不需要假定的催化残基。

拟南芥I型metacaspase管理模块的处理几乎能够完全消除植物细胞内免疫受体激活的细胞死亡超敏反应（hypersensitive response，HR）。

这不会导致加强病原体扩散，而是与HR限制病原体增长脱钩。

程序性细胞死亡对于植物的发展的必需的。

植物、真菌和原生动物中的metacaspases是CD半胱氨酸蛋白酶超家族（caspases, paracaspases, gingipains, clostripains, legumains, and separin）中半胱氨酸蛋白酶的远亲同源物。

这些与进化有关的蛋白酶与半胱氨酸蛋白酶-血红蛋白酶有相同的折叠和催化结构域。

拟南芥基因组编码三种I型和六种II型metacaspases（AtMCs）。

两种类型都包含保守的假定催化结构域和合理的自动催化位点但是它们的N-末端结构域不同。

尽管有许多关于植物中半胱氨酸蛋白酶类活动的报告，目前还没有实验数据可以说明植物I型metacaspases的功能和底物。

II型metacaspase功能几乎和谜一样：重组植物II型metacaspases AtMC4和AtMC9可以进行离体自动催化过程，并且Tudor金黄色葡萄球菌核酸酶，在松树细胞程序化死亡过程中被酶切成片段，是植物中发现的唯一一个体内II型metacaspase底物。

虽然经典的动物半胱氨酸蛋白酶在天冬氨酸之后也就是P1位切割，而metacaspases在普通的氨基酸残基比如赖氨酸或者精氨酸之后切割。

LSD1是细胞死亡的负调控因子，由超敏反应时的期的超生产启动，细胞的死亡常伴随着病原体的识别。

HR位点在lsd1上正常形成，但是活细胞和死细胞之间的明显的界限随后消失，并且保证整个叶片的细胞都死亡。

这种表型需要一种蛋白质，而这个蛋白质也是识别病原体和积累水杨酸所必需的。

因此，lsd1是
研究如何控制氧化应激相关的细胞死亡的一个敏感的遗传背景。

所有的三种拟南芥I型metacaspases，AtMC1（Atlg02170）、AtMC2（At4g25110）和AtMC3（At5g64240），有一个保守的，植物专一性的类LSD1锌指N-末端模体（CxxCRxxLMYxxGASxVxCxxC）。

LSD-1锌指结构域在蛋白质相互作用中可以发挥作用。

在酵母中，LSD1和AtMC1通过它们的锌指结构域相互作用。

相反，在这个分析当中AtMC2和AtMC1或者LSD1都只有微弱的相互作用。

我们证实了AtMC1-LSD1用于转基因拟南芥体内的免疫共沉淀和烟草瞬时表达分析的相互作用。

AtMC1预期的N-末端前域是与LSD1相互作用的。

在这些条件下AtMC2既不和LSD1也不和AtMC1免疫共沉淀。

当Col-0加入后，我们获得了atmc1、atmc2和lsd1的T-DNA插入突变的等位基因。

atmc1，atmc2和atmc1 atmc2双重突变型对活性氧的加强没有显示出迹象，也没有明显的表现型。

我们合成lsd1 atmc1和lsd1 atmc2双重突变型以及lsd1 atmc1 atmc2三重突变型来判断是atmc1或者是atmc2修改lsd1细胞死亡的表型。

lsd1启动细胞死亡可以被BTH，一种水杨酸类似物诱导。

BTH处理96h后lsd1显示出大量的离子散失（一种细胞死亡形式）。

Col-0野生型，atmc1、atmc2和atmc1 atmc2没有表现出明显的离子散失的增加。

lsd1 atmc1表现出受抑制的BTH 诱导的离子散失。

相反，lsd1 atmc2便显出加速的BTH诱导的离子散失。

lsd1 atmc1 atmc2和lsd1 atmc1中的离子散失相似。

将这些数据统一起来，在缺少AtMC1时，形态学上的lsd1表型将会死亡，并且lsd1 atmc2突变体会死更多。

因此，AtMC1是lsd1控制细胞死亡的正调控因子，而AtMC2在遗传上则作为AtMC1的负调控因子。

红血球凝集素（HA）抗原决定簇标记的AtMC1和AtMC2构建物受它们原本的启动子（pAtMC1::AtMC1-HA and pAtMC2::AtMC2-HA）调节，在lsd1中弥补了它们各自的突变型受BTH诱导的离子散失。

AtMC1-HA蛋白在喷涂BTH一天后可以被观察到，在植物显示任何可以被发现的细胞死亡特征之前，并且从喷涂以后开始积累。

AtMC2-HA蛋白在经过BTH处理后两天后才可以被观察到，且比AtMC1-HA积累量少。

我们没有观察到HA标记的小分子量产物，说明要么事在激活过程中缺少处理要么是假定的C-末端HA标记的片段不稳定。

我们监测AtMC1或者AtMC2在携带有β-葡萄糖苷酸酶（GUS）启动子报告
基因（pAtMC1::GUS和pAtMC2::GUS, 各自的）的转基因植物Col-0或者lsd1中的表达。

AtMC1在靠近叶脉附近表达。

然而，BTH处理24h后，AtMC1在lsd1中一些细胞死亡点附近表达出很窄的区域。

细胞表达AtMC1注定要死亡，像随时间流逝的失控的细胞死亡一样。

相反，AtMC2，在一个低水平上被表达，除了一些确定要死的没有染色描绘轮廓的细胞。

我们用专性活体营养型卵菌（Hpa；isolate Emwa1）或者半营养型丁香假单胞菌[Pto; strain DC3000(avrRpm1)]感染转基因植物Col-0 pAtMC1::GUS和pAtMC2:: GUS通过细胞内TIR和CC-NB-LRR各自的免疫受体RPP4和RPM1引发HR。

AtMC1由依赖NB-LRR识别病原体激活，随后在细胞中空间受限表达，且注定进行HR。

相反，AtMC2在感染点附近相对更加散开的区域表达。

我们有条件的合成转基因植物表达在缺乏类LSD1（分别是AtMC1-HA和AtMC1-ΔN-HA）时AtMC1的全部长度或者切掉N-末端的部分。

在Col-0转基因植物中高浓度的AtMC1-HA积累导致细胞死亡，而低浓度不然。

Col-0 AtMC1-ΔN-HA植物积累相对低浓度的蛋白质而显示出加强的死亡。

我们没有成功地在lsd1中恢复AtMC1-ΔN-HA转基因的表达，无论是直接的转化还是将独立的Col-0 AtMC1-ΔN-HA转基因月lsd1杂合（参见SOM上的方法）。

这些结果表明AtMC1的类LSD1假定的前域负调控之前的细胞死亡过程。

典型的半胱氨酸蛋白酶活性中心包括组氨酸和半胱氨酸双催化基团，这种基团在metacaspases也有。

预期的催化半胱氨酸的残基对于松树的metacaspase mcII-Pa，拟南芥的AtMC4、AtMC9，酵母的AtMC1、AtMC5的自动处理时必要的。

在布氏锥虫中，metacaspase TBMCA4，第二个metacaspase专一性的半胱氨酸残基是具有催化活性的，并且对应的残基是AtMC9经典半胱氨酸残基突变的补偿。

我生成Col-0转基因株系来高表达或低表达包含半胱氨酸到丙氨酸的突变的条件性的AtMC1表达构建物（AtMC1-C220A-HA）或者是包含潜在补偿性的半胱氨酸的双突变（AtMC1-C99A-C220A-HA）。

在条件下过表达的AtMC1-HA 导致了剂量-依赖性的离子的散失速度的提高，然而，AtMC-C220A-HA和AtMC1-C99A-C220A-HA没有上述现象。

因此，AtMC1-C220对于功能的实现是需要的，而AtMC1-C99不能补偿损失。

在感染之前，AtMC1的过表达不能导致子叶的细胞死亡。

然而，在用Hpa
感染和RPP4激活之后，大量的细胞死亡发生了。

因此，在树苗中的AtMC1激活，是成年植物的一个对比，需要一个额外的信号，这和lsd1启动的细胞死亡在子叶中不发生的事实是一致的。

我们合成相似的lsd1和Col-0转基因作物，有条件的表达AtMC2（AtMC2-HA）的全长，AtMC2切除N-末端的类似物（AtMC2-ΔN-HA）和AtMC2或者AtMC2-ΔN，带有在假定的催化残基部位半胱氨酸到丙氨酸突变或者是潜在地补偿性的半胱氨酸残基（AtMC2-C135A-C256A-HA和AtMC2- ΔN-C135A-C256A-HA）。

BTH诱导的lsd1启动的细胞死亡在表达AtMC2-HA全长的转基因株系中受到抑制。

细胞死亡在AtMC2-ΔN-HA–表达株系中几乎完全被抑制。

令人惊奇的是，AtMC2或者AtMC2-ΔN-HA中的细胞死亡抑制都不需要就假定的催化性的半胱氨酸。

为了评估AtMC2是否抑制NB-LRR-调控的HR，我们感染了表达AtMC2-ΔN-HA或AtMC2-ΔN-C135AC256A-HA带有Pto DC3000（avrRpm1）的Col-0、atmc1、atmc2、atmc1 atmc2以及转基因植物。

我们在atmc2中观察到RPM 1-调控的HR有所增强。

相反，我们观察到接种少量的细菌菌液的atmc1和atmc1 atmc 2的RPM1-调节的HR的抑制，像自然的感染一样，但不是在人工高的剂量的条件下。

有条件的表达AtMC2-ΔN或者AtMC2全长抑制RPM1-调节的HR，模拟atmc1。

HR的抑制没有导致增强的Pto DC3000（avrRpm1）的易感性。

RPP4-调节的HR也被AtMC2-ΔN的条件性表达和在atmc1中抑制。

因此，AtMC2通过直接的或者间接的调控AtMC1来禁止至少是RPM1-和RPP4-调节的HR。

AtMC2上的假定催化位点对于HR抑制没有必要。

atmc2没有显示出RPP4-调控的HR的增强。

虽然Hpa Emwa1是专性的生体营养卵菌，AtMC2-ΔN-调控的HR 抑制并没有解除RPP4-依赖性的病原体生长约束。

这些惊人的观察现象和之前的结果是一致的，这些结果表明HR可以在没有病原体生长约束的情况下发生和HR可以被半胱氨酸蛋白酶抑制剂禁止。

病原菌应力标记PR1没有被AtMC2-ΔN 过表达诱导，表明这些结果不是压迫的普遍的后果。

最后，AtMC1的AtMC2控制是遗传转录后的。

我们的数据把AtMC1确定为死亡前类半胱氨酸蛋白酶蛋白质，对于在活性氧敏感的条件下的超氧依赖性的细胞死亡和被细胞内的NB-LRR免疫的受体蛋白质调控的HR是必要的。

AtMC2抵消这些功能。

AtMC1和AtMC2包含一个与
LSD1共用的植物专一性的N末端。

AtMC1和AtMC2两者的功能都被移除这个结构域所加强，至少对于AtMC1来说，这个结构域对于和LSD1相互作用是需要的。

当没有LSD1时，AtMC1-以来的细胞死亡需要额外的，不知道的信号，并且发展中受到调控。

因此，AtMC1的激活是复杂的，也有可能是上下关联的。

AtMC2功能的禁用不需要经典的半胱氨酸催化残基。

AtMC1-AtMC2的拮抗作用动物半胱氨酸蛋白酶-12的回忆，负调控半胱氨酸蛋白酶-1来一直对细菌炎症性的应答和结肠炎相关的癌症；半胱氨酸蛋白酶-12的这些功能不需要催化功能。

半胱氨酸蛋白酶-12也抑制独立于半胱氨酸蛋白酶-1的类NOD受体调控的先天性免疫，提供给我们的观察一个惊人的对照，那就是AtMC2抑制类似的植物NB-LRR先天性免疫受体控制的AtMC1-依赖性的细胞死亡。

这些结果表明metacaspase/caspase蛋白酶趋异进化和受NB-LRR或者NLR蛋白质管理的先天免疫受体的功能控制的细胞死亡的原始联系。

出自CCNU08级。