一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶及其制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810539371.5
(22)申请日 2018.05.30
(71)申请人 中山大学
地址 510275 广东省广州市海珠区新港西
路135号
(72)发明人 吴钧　王彦　张少瀚　欧乾民　
顾志鹏　
(74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限
公司 44102
代理人 陈卫
(51)Int.Cl.
A61L 26/00(2006.01)
(54)发明名称一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶及其制备方法和应用。

所述水凝胶包括模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水；其中，聚多巴胺纳米粒子和聚乙二醇双丙烯酸酯的质量百分比之和为10%～23%，水的质量百分比为75%～88%。

该水凝胶具有生物相容性好、无细胞毒性的优点；具有良好的保湿作用和透气性，不会导致伤口脱水；具有良好的吸收创伤分泌物的功能；具有良好的透氧性能和药物控释能力，可以使疏水药物缓慢释放，起到缓释控释效果，使血药浓度保持在平稳持久的有效范围内，进而可以延长药物作用时间，具有充分抑制伤口感染、高效促进创面伤口愈合的功能，并且安全性高，使用方便，具有
广阔的应用前景。

权利要求书1页 说明书9页 附图6页CN 108744025 A 2018.11.06
C N 108744025
A
1.一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，包括模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水；其中，聚多巴胺纳米粒子和聚乙二醇双丙烯酸酯的质量百分比之和为10%～23%，水的质量百分比为75%～88%。

2.根据权利要求1所述的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，所述模式药物、聚多巴胺纳米粒子与聚乙二醇双丙烯酸酯的质量比为0.05～0.15:1:5～10。

3.根据权利要求1所述的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的含量为12%～20%。

4.根据权利要求1所述的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，所述光引发剂的含量为0.05%～2%。

5. 根据权利要求1所述的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，所述聚多巴胺纳米粒子的水合粒径为78.82～458.70 nm。

6.根据权利要求1所述的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，其特征在于，所述模式药物为葛根素、白藜芦醇或维生素C。

7.权利要求1～6任一项所述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 将纯水、乙醇和氨水混合搅拌均匀，加入多巴胺，反应4～6 h，得到聚多巴胺纳米粒子；
S2. 将模式药物溶解在乙醇中，得到模式药物乙醇溶液，再与聚多巴胺纳米粒子稀释液搅拌混匀，反应1～3 h，得到聚多巴胺载药溶液；
S3. 向聚多巴胺载药溶液加入聚乙二醇双丙烯酸酯和光引发剂，充分混匀后注入模具，经强度为50～150 mW/cm 2紫外光照射100～500 s，即可得到所述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S1所述纯水、乙醇和氨水的体积比为13～5：4：0.5。

9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S3所述聚多巴胺载药溶液的浓度为1～20 mg/mL；所述聚多巴胺载药溶液的水合粒径为141.80～712.04 nm。

10.权利要求1～6任一项所述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶在制备或用作伤口敷料中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 108744025 A
一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶及其制备方法和
应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域。

更具体地，涉及一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术
[0002]治疗皮肤创伤的基本目标是加快创面的愈合速度，预防细菌感染，减轻出血、炎症反应、伤口感染甚至溃疡带给患者的痛苦，防止创伤对生理机能的负面影响，以及愈后伤口尽可能美观。

皮肤创伤愈合的过程分为凝血期、炎症期、细胞增殖期以及组织重塑期，是一个牵涉到凝血、炎症、血管重塑、上皮细胞增殖迁移以及组织重塑等等诸多因素的复杂过程，愈伤的结果也是由这许多因素之间的平衡所决定。

在此过程中，过低的药物浓度不能起到治疗作用；过高的药物浓度则会产生副作用，甚至会损害正常的组织器官。

此外，皮肤愈合效果还取决于药物能否在创伤部位保持足够的时间。

为提高药物疗效，往往要增加药物浓度和给药次数，但过多药物会损害正常的组织和器官。

[0003]创面愈合的过程是细胞与细胞、细胞基质及可溶性介质之间相互作用的一个动态过程。

在临床上，常用医用敷料覆盖在创伤表面促进愈合。

传统敷料因存在无法促进伤口愈合、伤口愈合时间长，并且使用时易粘连伤口造成二次损伤、止血性不强，易感染，敷料使用量大等诸多缺点，使得人们不断对传统敷料进行改进。

而目前应用较多的藻酸盐类敷料和聚合类水胶体敷料，前者对干燥或者硬痂类创面不宜使用，后者存在生物学功能不显著等不足。

水凝胶敷料作为敷料的一种，它能不断吸收创面渗出液，保持创面湿润、清创和加快伤口的愈合，因此受到人们的青睐。

但是，一方面，其作为药物载体必须要具备药物的装载与控释能力；另一方面，其本身所具备的性能也会对创面的有效愈合产生重要影响。

而如何在保证水凝胶敷料自身具有优越性能的前提下，同时有效提高其对药物的装载与控释能力是当前面临的主要技术困难。

[0004]葛根素分子具有多羟基和多苯环结构，导致其脂溶性和水溶性均较差，不仅使得其口服效果差且生物利用度低，而且导致其在普通水凝胶中的装载也受到一定的限制，极大地限制了其临床应用。

此外，由于水溶性较差的药物与亲水性的水凝胶主链相容性较差，包埋在水凝胶网络中的水溶性较差的药物会很快通过渗透的方式释放出来，这样也就不能保证治疗的效果。

发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种具有药物控释能力的用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶。

该水凝胶制备方法简单，制备成的水凝胶具有良好的保湿作用、透气性以及无细胞毒性，同时又具有对疏水性药物控释的能力，比传统的水凝胶更能控制药物缓慢平稳的释放，使血药浓度保持在更为平稳持久的有效范围内，进而可以延长药物作用时间，提高了药物的生物利用度，有利于伤口愈合，同时提高
了药物的安全性。

[0006]本发明的目的是提供一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶。

[0007]本发明另一目的是提供上述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶的制备方法。

[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶，包括模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水；其中，聚多巴胺纳米粒子和聚乙二醇双丙烯酸酯的质量百分比之和为10%～23%，水的质量百分比为75%～88%。

[0009]优选地，所述水凝胶由模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水在紫外光照射的条件下制备而成。

[0010]本发明克服单一水凝胶药物的缺点，将模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水在紫外光照射的条件下制备成复合水凝胶，使复合水凝胶既具有良好的机械性能和生物性能，同时又具有对疏水性药物控释的能力，比传统的水凝胶更能控制药物缓慢平稳的释放，使血药浓度保持在更为平稳持久的有效范围内，进而可以延长药物作用时间，有利于伤口愈合，同时提高了药物的安全性。

[0011]优选地，所述模式药物、聚多巴胺纳米粒子与聚乙二醇双丙烯酸酯的质量比为0.05～0.15:1:5～10。

[0012]更优选地，所述模式药物、聚多巴胺纳米粒子与聚乙二醇双丙烯酸酯的质量比为0.1:1:5～10。

[0013]更进一步优选地，所述模式药物、聚多巴胺纳米粒子与聚乙二醇双丙烯酸酯的质量比为0.1:1:7.5。

[0014]优选地，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的含量为12%～20%。

[0015]更优选地，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的含量为15%。

[0016]优选地，所述光引发剂的含量为0.05%～2%。

[0017]更优选地，所述光引发剂的含量为1%。

[0018]优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的水合粒径为78.82～458.70 nm。

[0019]更优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的平均水合粒径为136～147 nm。

[0020]更进一步优选地，所述聚多巴胺纳米粒子的平均水合粒径为141.8 ± 4.61 nm。

[0021]优选地，所述光引发剂为I2959、二苯甲酮、安息香丁醚、异丙基硫杂蒽酮、二苯基乙酮或苯甲酰甲酸甲酯中的一种或多种。

[0022]更优选地，所述光引发剂为I2959。

[0023]优选地，所述模式药物为葛根素、白藜芦醇或维生素C等抗氧化药物。

[0024]本发明还提供了所述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1. 将纯水、乙醇和氨水混合搅拌均匀，加入多巴胺，反应4～6 h，得到聚多巴胺纳米粒子；
S2. 将模式药物溶解在乙醇中，得到模式药物乙醇溶液，再与聚多巴胺纳米粒子稀释液搅拌混匀，反应1～3 h，得到聚多巴胺载药溶液；
S3. 向聚多巴胺载药溶液加入聚乙二醇双丙烯酸酯和光引发剂，充分混匀后注入模具，经强度为50～150 mW/cm2（优选100 mW/cm2）紫外光照射100～500 s，即可得到所述用于
促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶。

[0025]优选地，S1所述氨水为30%氨水溶液。

[0026]优选地，S1所述纯水、乙醇和氨水的体积比为13～5：4：0.5。

[0027]更优选地，S1所述纯水、乙醇和氨水的体积比为9：4：0.5。

[0028]优选地，S2中模式药物乙醇溶液与聚多巴胺纳米粒子稀释液的浓度比为40：1～5。

[0029]更优选地，S2中模式药物乙醇溶液与聚多巴胺纳米粒子稀释液的浓度比为40：2。

[0030]优选地，所述聚多巴胺载药溶液的水合粒径为141.80～712.04 nm。

[0031]更优选地，所述聚多巴胺载药溶液的平均水合粒径为275～300 nm。

[0032]更进一步优选地，所述聚多巴胺载药溶液的平均水合粒径为287.7 ± 12.44 nm。

[0033]优选地，S3所述聚多巴胺载药溶液的浓度为1～20 mg/mL。

[0034]更优选地，S3所述聚多巴胺载药溶液的浓度为5～10 mg/mL。

[0035]本发明涉及的水凝胶愈合皮肤创伤作用是通过建立大鼠皮肤创伤模型，研究葛根素水凝胶在创伤愈合过程的作用。

[0036]所述水凝胶兼有抗氧化功能和细胞外基质环境作用，具有良好的维持创面生理性湿润的功能，可以吸收自身质量的2000倍液体，具有良好的透气性；同时其抗氧化功能，可以刺激伤口附近细胞分泌血管内皮生长因子，有利于加速伤口愈合，并且生物相容性好；另外，聚多巴胺纳米粒子载体可使得药物葛根素缓慢释放，进而高效将伤口治愈，其作为新型生物活性敷料应用前景广阔。

[0037]相应地，所述用于促进伤口愈合的抗氧化性能水凝胶在制备或用作伤口敷料中的应用，也在本发明的保护范围之内。

[0038]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用模式药物、聚多巴胺纳米粒子、聚乙二醇双丙烯酸酯、光引发剂和水一起聚合反应制备水凝胶，优点包括：第一，该水凝胶具有良好的生物相容性、无细胞毒性的优点，细胞存活率高；第二，具有良好的保湿作用和透气性，使得水凝胶获得一定程度的水蒸气透过率，在用作伤口敷料时，不会导致伤口脱水，同时使伤口免受缺氧环境的负面作用；第三，具有良好的吸收渗液作用，可以大量吸收伤口的渗出液，使伤口表面没有渗液存留而影响愈合；第四，具有对疏水性药物控释的能力，比传统的水凝胶更能控制药物缓慢平稳的释放，可以延长药物的作用时间，使血药浓度保持在更为平稳持久的有效范围内，进而可以延长药物作用时间，提高了药物的生物利用度，有利于伤口愈合，疗效明显提高，同时减少了给药量和给药次数，降低了用药成本，并且提高了药物的安全性；第五，具有充分抑制伤口感染、高效促进创面伤口愈合的功能，并且安全性高，使用方便。

附图说明
[0039]图1为聚多巴胺纳米粒的水合粒径统计图。

[0040]图2为葛根素-聚多巴胺纳米粒的水合粒径统计图。

[0041]图3为制备水凝胶的实物图。

[0042]图4为制备水凝胶的扫描电子显微镜放大100倍图。

[0043]图5为制备水凝胶的扫描电子显微镜放大200倍图。

[0044]图6为水凝胶随时间释放药物葛根素的折线统计图。

[0045]图7为水凝胶在PBS溶液中随时间而溶胀的折线统计图。

[0046]图8为MTT法检测凝胶的细胞相对存活率图。

[0047]图9为使用荧光显微镜观察活死细胞染色检测细胞生物相容性图。

[0048]图10为MTT法检测凝胶的抗氧化性图。

[0049]图11为荧光显微镜观察凝胶的抗氧化性图。

[0050]图12为流式细胞仪检测凝胶的抗氧化性图。

[0051]图13为对照组和水凝胶组在治疗前后的伤口部位的照片。

具体实施方式
[0052]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0053]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0054]实施例1 水凝胶的制备（Gel-3:PEG-DA/PDA/PUE(H)）
1、水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将9 mL的纯水和4 mL乙醇、0.5 mL 30%氨水在圆底烧瓶里搅拌均匀，再加入20 mg 多巴胺粉末，反应5 h，得到聚多巴胺纳米粒子；
（2）将20 mg葛根素溶解在0.5 mL乙醇中，再与10 mL浓度为2 mg/mL聚多巴胺纳米粒稀释液搅拌充分混匀，反应2 h，得到葛根素/聚多巴胺载药溶液；
（3）将150 mg聚乙二醇双丙烯酸酯（PEG-DA）粉末加入上述葛根素/聚多巴胺载药溶液中，使葛根素、聚多巴胺纳米粒子与聚乙二醇双丙烯酸酯的质量比为0.1：1：7.5，其中葛根素/聚多巴胺载药溶液的浓度为10 mg/mL，PEG-DA的含量为15%；再加入1%的光引发剂I2959，充分混匀后注入模具，经强度为100 mW/cm2紫外光照射300 s，得到水凝胶Gel-3: PEG-DA/PDA/PUE(H)。

[0055]2、结果
（1）聚多巴胺纳米粒子的粒径测试
将上述步骤1中的溶液转移到超速离心管内，转速为3000 rpm/min离心10 min。

将超离的清液和浓缩液分离开，将浓缩液稀释待用，使用纳米粒度仪测得聚多巴胺纳米粒子的水合粒径为78.82～458.70 nm；平均水合粒径为141.8 ± 4.61 nm，如图1所示。

[0056]（2）葛根素/聚多巴胺载药溶液的粒径测试
将上述步骤2中的溶液转移到超速离心管内，转速为3000 rpm/min离心10 min。

将超离的清液和浓缩液分离开，将浓缩液稀释待用，使用纳米粒度仪测得葛根素/聚多巴胺载药纳米粒子的水合粒径为141.80～712.04 nm；平均水合粒径为287.7 ± 12.44 nm，如图2所示。

[0057]（3）该水凝胶的实物图见图3所示，水凝胶形状完整，呈果冻状，弹性好，机械强度好，经测试得其弹性模量为1.32 ± 0.18 Mpa。

[0058]（4）该水凝胶的扫描电子显微镜图放大100倍见图4、放大200倍见图5所示，从图中可以看出该水凝胶具有致密的多孔三维网络结构，与普通水凝胶相比，本发明水凝胶的孔径更小，孔隙更为均匀。

[0059]实施例2 水凝胶的制备（Gel-2：PEG-DA/PDA/PUE(L)）
1、制备方法
其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：葛根素/聚多巴胺载药溶液的浓度为5 mg/ mL，得到水凝胶Gel-2：PEG-DA/PDA/PUE(L)。

[0060]2、结果
（1）其实物图见图3所示，水凝胶形状完整，呈果冻状，弹性好，机械强度好，经测试得其弹性模量是0.64 ± 0.05 Mpa。

[0061]（2）其扫描电子显微镜图放大100倍见图4、放大200倍见图5所示，从图中可以看出该水凝胶拥有多孔三维网络结构，孔隙较均匀。

[0062]实施例3 水凝胶的制备（Gel-1：PEG-DA，不含葛根素）
1、制备方法
其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：不加入葛根素/聚多巴胺载药溶液，得到水凝胶Gel-1：PEG-DA（不含葛根素）。

[0063]2、结果
（1）其实物图见图3所示，水凝胶呈果冻状，弹性好，机械强度好，经测试得其弹性模量为0.44 ± 0.05 Mpa。

[0064]（2）其扫描电子显微镜图放大100倍见图4、放大200倍见图5所示，从图中可以看出该水凝胶呈现多孔三维网络结构。

[0065]实施例4 性质测试
1、葛根素/聚多巴胺载药溶液载药能力的评价
（1）方法
评价一个药物载体的优劣，载药量是一个重要指标。

为了测定药物葛根素的准确含量，按照《中华人民共和国药典版》2000版的规定，采用紫外分光光度计250 nm测量处药物的吸光度。

测定前需要绘制一条线性相关系数很高的浓度一吸光度标准曲线。

以pH=7.4的PBS缓冲液为溶剂，用容量瓶准确配制的葛根素标准溶液。

分别用紫外分光光度计测250 nm处的吸光度。

然后，称取一定质量的葛根素-聚多巴胺粒子，配置成溶液，然后超声破碎粒子，加入适量的甲醇充分溶解葛根素，经离心后取上清液过滤，通过高效液相在250 nm下测定葛根素的含量。

[0066]载药量的计算公式为：载药量（%）=（投入的总药量-游离的药量）/载体的质量* 100%。

[0067]（2）结果
计算得出制备的聚多巴胺纳米粒子的葛根素载药量为7.81 ± 1.27%。

根据文献可以推测聚多巴胺纳米粒子负载药物葛根素主要通过π-π堆积和氢键相互作用力。

此外，随着装载药物的浓度增加，水凝胶中药物的装载量也增加。

这样在治疗期间保证了药物的浓度。

[0068]2、水凝胶体外释放葛根素实验
（1）方法
将本发明水凝胶和葛根素/聚多巴胺载药溶液分别置于20 mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中，然后放于震荡速度为100 rpm的37℃恒温摇床中。

在特定时间点取出1 mL释放介质，再补加等量的新鲜的缓冲溶液。

通过高效液相在250 nm下测定葛根素的含量。

[0069]（2）结果
水凝胶体外释放葛根素结果见图6。

研究发现，在第一天内葛根素-聚多巴胺粒子体系可以释放83%药物葛根素，而在水凝体系中释放60%药物葛根素。

随后十天的释药观察发现，水凝胶体系可以使葛根素缓慢释放，进而可以延长药物治愈作用时间。

结果表明，随着时间的延长药物葛根素逐渐从水凝胶中平稳的释放出来，水凝胶具有缓释控释效果，这样一方面药物释放的时间得以延长，另一方面在治疗初期，有足够的药物浓度保证治疗效果。

[0070]3、水凝胶的溶胀实验
（1）方法
溶胀实验表明了水凝胶的吸收水分的能力。

水凝胶的溶胀比通过称重法来测定。

将干燥的样品称重后置于PBS溶液中，然后置于37℃的恒温水浴，在设定的时间下，取出样品，用滤纸拭干其表面的多余水分，称重，按下式计算水凝胶的溶胀率：溶胀率（%）=溶胀前后的质量差/溶胀前的质量×100。

[0071]（2）结果
水凝胶的溶胀率结果见图7。

在七天溶胀测试中，可以观察到凝胶可以吸收PBS溶液高达自身的2000倍，因此，本发明的水凝胶可以大量吸收伤口的渗出液，使伤口表面没有渗液存留而影响愈合。

[0072]4、水蒸气透过率
（1）方法
水凝胶的透气性表明当水凝胶覆于伤口时，水凝胶的透气性能。

水凝胶膜的水蒸气透过率测试是根据美国标准局公布的ASTM E96-00方法而测量得到。

将已制备好的的水凝胶膜放置在圆柱形玻璃瓶口，玻璃瓶中装有10 mL水，塑玻璃瓶口边缘用聚四氟乙烯带密封以防止任何水汽从杯口边缘损失。

然后在37℃时，把塑料杯放进含有硫酸铵饱和溶液的干燥器中（相对湿度79%）。

水凝胶的透气性按以下公式计算：
透气性=蒸发前后损失水的质量/（蒸发时间×截面积）
（2）结果
水凝胶的水蒸气透过率结果如表1所示。

[0073]表1 水凝胶透气性的统计表
分组水凝胶的透气性（g/m2·24h）
Gel-1：PEG-DA2364.67±937.67
Gel-2：PEG-DA/PDA/PUE(L)2344.51±356.39
Gel-3：PEG-DA/PDA/PUE(H)2561.23±972.72
在37℃的恒温条件下，正常人体皮肤24 h的蒸发水蒸气的速率240～1920 g/m2，而未覆盖伤口24 h的水蒸气透过速率可达5000～7000 g/m2。

在凝胶形成过程中由于化学键的形成孔隙结构，使得凝胶获得一定程度的水蒸气透过率。

因此在应用时，该水凝胶不会导致伤口脱水。

[0074]5、水凝胶的生物相容性
为了考察水凝胶的生物相容性，采用MTT法和活死细胞染色测定了细胞与水凝胶共培养后，细胞的存活率变化。

[0075]（1）方法
首先将灭菌后的水凝胶平铺在孔板底部，再将细胞种植在24孔板内，密度104 cells/ well，每孔含200 μL的DMSO（10% FBS，含青霉素和链霉素各100 U/mL）。

将上述培养板置于二氧化碳培养箱（37℃，5% CO2）中，培养到设定的时间，去除培养基后用PBS清洗三遍，加入含有5 mg/mL MTT试剂的DMEM，继续培养4 h后，去除培养基，每孔中加200 μL的DMSO溶液，将紫色物质溶解后，在酶标仪上测定吸光度值。

将不加入水凝胶所培养的细胞的第一天存活率定义为100%，其余各组数值与之相比，分别观察1、4、7天的细胞相对存活率。

[0076]（2）结果
实验结果见图8。

细胞相对存活率高，说明细胞在水凝胶上能较好地生长，细胞形态良好，制备的水凝胶无明显毒性，具有良好的细胞相容性。

同时，使用活死细胞染色试剂染色第一天培养细胞后，使用倒置荧光显微镜观察后，得出相同的结果，水凝胶具有良好的细胞生物相容性（见图9）。

[0077]6、水凝胶的抗氧化性能的研究
（1）抗氧化性能
取细胞选取牙髓干细胞种植在24孔板内，密度为2×104个/mL细胞悬液于6孔板块中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为100 μL H2O2，空白对照组加入等体积培养基。

细胞培养24 h 后，用MTT和活死细胞染色，观察细胞的生存状况（见图10和11）。

分别使用50 μM和100 μM的H2O2处理细胞后，得到处于氧化应激状态的细胞后，分别于制备的水凝胶共培养后观察到凝胶Gel3：PEG-DA/PDA/PUE(H)在24 h内抗氧化效果明显。

[0078]（2）细胞内ROS积累的检测
取细胞种植在6孔板内，密度为2×104个/mL细胞悬液于6孔板块中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为100 μL H2O2，空白对照组加入等体积培养基。

细胞培养24 h后，加入终浓度为20 μmol/L的DCFH-DA染料再培养30 min后，将细胞消化和收集并重悬于500 μL的PBS溶液中，经流式细胞仪检测细胞内ROS积累程度。

[0079]结果如图12和表2所示，得到凝胶Gel3：PEG-DA/PDA/PUE(H)的抗氧化效果最明显。

[0080]表2 流式细胞仪检测的荧光强度
分组荧光强度
Control49.32%
Gel-1：PEG-DA46.43%
Gel-2：PEG-DA/PDA/PUE(L)44.04%
Gel-3：PEG-DA/PDA/PUE(H)27.93%
7、水凝胶促进伤口愈合的体内研究
（1）方法
选取重约200 g雄性SD大鼠，自由饮水和采食，并且每天更换垫料。

在实验开始之前，所有的大鼠进入研究条件下经过为期3天的适应性喂养后，进行标记和称重。

随后对大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉后，在大鼠背部造成直径为1.5 cm的圆形皮肤缺损伤口。

水凝胶促进伤口愈合的体内研究共分为四组，分别是Gel1：PEG-DA水凝胶组，Gel2：PEG-DA/PDA/PUE(L)水凝胶组，Gel3：PEG-DA/PDA/PUE(H)水凝胶组，和生理盐水对照组，并每天换药。

[0081]（2）结果。