注射黄芪多糖对吉富罗非鱼热应激蛋白基因表达的影响

注射黄芪多糖对吉富罗非鱼热应激蛋白基因表达的影响
汤菊芬;吴灶和;简纪常;鲁义善;王蓓
【摘要】将黄芪多糖(APS)用无菌生理盐水配制成2 mg/mL(低剂量)、20 mg/ mL(高剂量)两种针剂,腹腔注射吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus).分别在注射后0h、24h、48 h、72 h和96 h采样提取吉富罗非鱼鳃、头肾、肝脏和脾脏组织中的总RNA,并反转录成cDNA,利用Real-time PCR方法对不同组织中的热应激蛋白(hsp70)基因表达进行定量分析.结果显示,在24h时,高剂量组吉富罗非鱼鳃、头肾和肝脏三个组织中hsp70基因的表达量显著高于同期对照组(P＜0.05),之后表达量快速降低,低剂量组hsp70基因表达量仅在脾脏中有上调.实验表明,APS可通过诱导吉富罗非鱼hsp70基因表达来保护免疫细胞免受应激损伤,从而增强鱼体抵抗病原菌的能力.%Astragalus polysaccharides (APS) was dissolved in sterile saline at the doses of 2 mg/mL (low dose), 20 mg/mL (high dose) to inject Oreochromis niloticus intraperitoneally, and the effects of APS on gene expression of hsp70 in gill, head kidney, liver and spleen of 0. Niloticus were determined using quantitative real-time polymerase chain reac tion at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after intraperitoneal injection. The results revealed that the gene expression level of hsp70 in gill, head kidney and liver of high dose group increased significantly than those of control group (P <0. 05) at 24 h, but decreased quickly afterwards. The gene expression of hsplO was up-regulated only in the spleen in low dose group (P <0.05) at 24 h. These results indicated that APS could protect immune cell from heat injury and enhance the fish immunity against infection of bacterial pathogen by inducing the expression of hsp70 of 0. Niloticus.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2011(041)006
【总页数】4页(P15-18)
【关键词】黄芪多糖;吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus);热应激蛋白70(hsp70)基因
【作者】汤菊芬;吴灶和;简纪常;鲁义善;王蓓
【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524025;仲恺农业工程学院,广州510225;广东海洋大学水产学院,广东湛江524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524025;广东海洋大学水产学院,广东湛江524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524025;广东海洋大学水产学院,广东湛江524025;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524025
【正文语种】中文
【中图分类】S948
热应激蛋白又称为热休克蛋白，是生物细胞在受到热、病原体、理化有害因素等刺激后发生热休克反应而产生的一类蛋白质[1-2]，其中热应激蛋白70(hsp70)是目前国内外研究较多，也是最重要的一类热应激蛋白。

已有研究表明，动物机体的热耐受力和免疫功能均与hsp70基因的表达量密切相关[3-4]。

许多具有免疫增强作
用的中草药或免疫多糖不仅能显著提高养殖动物的非特异性免疫功能[5-7]，还能
诱导hsp70在各种免疫组织中表达[8-9]。

黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides,APS)是从黄芪根部分离出的多糖组分,由葡萄糖、半乳糖、阿拉
伯糖等组成，具有增强免疫功能、提高机体抗应激能力以及抗菌抑制病毒等方面的作用，APS作为一种新型的免疫增强剂已被广泛应用于禽畜和水产养殖业中。

近
几年来，华南地区受持续高温天气影响，罗非鱼琏球菌病频发。

本实验以吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromis niloticus)为实验对象，通过给吉富罗非鱼腹腔注射不同
剂量的APS，研究APS对吉富罗非鱼hsp70基因表达量的影响情况，为APS在
罗非鱼抗热应激和疾病防控方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 实验材料
GIFT鱼苗购自广东省湛江市吴川某罗非鱼种苗基地。

在广东海洋大学东海岛高新
科技园喂养2个月后，挑选健康、规格整齐、平均体重为(68.21±1.18)g的个体作为实验用鱼。

Trizol试剂购自广州英韦创津生物科技有限公司，cDNA一链合成试剂盒、TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 药剂制备
90% APS购于江苏南通四海植物精华有限公司，将APS溶于无菌生理盐水中后过滤除菌(0.22 μm滤膜)，配制成2 mg/mL(低剂量)和20 mg/mL(高剂量)两种针剂，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 分组及采样
同批同龄体重为(68.21±1.18) g的吉富罗非鱼，被随机分配到9个玻璃钢桶(水容量为3 L)中，对照组、低剂量组和高剂量组各设3个重复，每个玻璃钢桶放罗非
鱼30尾。

对照组腹腔注射0.1 mL无菌生理盐水，低剂量组腹腔注射0.1 mL(2
mg/mL)APS针剂，高剂量组腹腔注射0.1 mL(20 mg/mL)APS针剂。

分别在注射后0、24、48、72 h和96 h每组随机抽取6尾罗非鱼，解剖并分别采集鳃、头肾、肝脏、脾脏组织，经液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.4 组织中总RNA的提取
按常规分子生物学方法进行。

1.5 cDNA第一链合成
以总RNA为模板，按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书逆转录反应合成cDNA，逆转录产物置于-20 ℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR
根据GenBank中各种鱼的hsp70、内参β-肌动蛋白(β-actin)的cDNA序列，用Primer 5.0软件设计引物(如表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RT-PCR中所用引物Tab.1 Primers used in RT-PCR引物名称扩增基因引物序列产物长度(bp)hsp70Fhsp70Rhsp705'-GCTCTGAACCCCAGCAACACT-3'5'-TTGTCCTCCCCTTTGTACTCCA-3'140βFβRβ-actin5'-GAAATCGTGCGTGACATCAA-3'5'-CCAGGCAGCTCGTAACTCT-3'120
以用无菌水稀释的cDNA一链为模板，在0.2 mL 8连管中依次加入cDNA模板2 μL，2×TransStart TM Green qPCR super Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，无菌水6 μL。

反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环，72 ℃ 30 s。

1.7 数据统计与分析
应用iQTM 5 Optical System Software软件，采用ΔCt法自动进行目标基因的荧光定量分析；应用SPSS 11.5软件对获得的实验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan′s多重比较，以检验不同处理间目标基因的表达差异，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果
2.1 APS对吉富罗非鱼hsp70基因在鳃中表达量的影响
APS对GIFThsp70基因在鳃中表达量的影响如图1所示。

高剂量组hsp70基因的表达量在24 h时最高(P<0.05),24 h后逐渐降低，但在48 h仍显著高于同期对照组和低剂量组；低剂量组hsp70基因的表达量在整个实验过程中与对照组比较无显著差异(P>0.05)。

图1 APS对GIFT hsp70在鳃中基因表达量的影响Fig.1 Effect of APS on the expression of hsp 70 gene in gill of O.niloticus
2.2 APS对GIFThsp70基因在头肾中表达量的影响
APS对GIFThsp70基因在头肾中表达量的影响如图2所示。

低剂量组hsp70基因的表达量与对照组相比较无显著差异(P>0.05)，高剂量组hsp70基因的表达量在24 h和48 h时显著高于对照组和低剂量组(P<0.05)。

图2 APS对GIFThsp70在头肾中基因表达量的影响Fig.2 Effect of APS on the expression of hsp70 gene in head kidney of O.niloticus
2.3 APS对GIFThsp70基因在肝脏中表达量的影响
APS对GIFThsp70基因在肝脏中表达量的影响如图3所示，低剂量组hsp70基因表达量与对照组比较无显著差异(P>0.05)，高剂量组hsp70基因的表达量在24 h和48 h时显著高于对照组和低剂量组(P<0.05)。

图3 APS对GIFThsp70在肝脏中基因表达量的影响Fig.3 Effects of APS on the expression of hsp70 gene in liver of O.niloticus
2.4 APS对GIFThsp70基因在脾脏中表达量的影响
APS对GIFThsp70基因在脾脏中表达量的影响如图4所示，低剂量组hsp70基因的表达量在24 h时显著高于对照组和其他实验组(P<0.05)，高剂量组hsp70基因在整个实验过程中表达量与对照组比较无显著差异(P>0.05)。

图4 APS对GIFThsp70在脾脏中基因表达量的影响Fig.4 Effect of APS on the expression of hsp70 gene in spleen of O.niloticus
3 讨论
据报道,中药抗应激冲剂可通过增加猪肝脏hsp70 含量水平来提高机体细胞热耐受[10]；清热复方中草药可诱导热应激大鼠(Rattus norvegicus)肝脏组织中hsp70表达量的增加，提高组织细胞的耐受性[11]；女贞子、五味子和四君子汤能显著提高热应激下蛋鸡(Gallus domestiaus)肝脏中hsp70基因的表达量，减轻热应激对蛋鸡的危害[12]。

雷爱莹等[13]报道，用含1%的复方中草药饲料喂养凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)10 d后，凡纳滨对虾肝组织中hsp70基因的mRNA表达量显著高于对照组。

Ellen等[14]给鲤(Cyprinus carpio)腹腔注射1 mL(2
mg/mL尾)酵母多糖，在注射后24 h时，hsp70基因表达量在头肾中显著上调，之后表达量迅速降低。

本实验的研究结果证实，注射一定剂量的APS能显著提高GIFThsp70基因在鳃、头肾、肝脏和脾脏组织中的表达量。

注射高剂量的APS针剂后24 h至48 h内，hsp70基因在鳃、头肾和肝脏三个组织中的表达量显著高于同期对照组，注射低剂量的APS针剂后hsp70基因表达量仅在24 h时在脾脏中上调。

可见APS可通过诱导GIFThsp70基因在鳃、头肾、肝脏和脾脏组织中表达，使罗非鱼提早达到热适应状态。

此外，本实验结果中，注射高剂量的APS后，GIFThsp70基因在头肾中的表达量在24 h和48 h时显著上调，与Ellen等[14]的研究结果稍有差异，可能与所注射的多糖类型及实验用鱼的种类等不同有关。

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