HPLC法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量

HPLC 法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、
新橙皮苷和辛弗林的含量
承晨，李莉*
作者简介 承晨，女,副主任中药师 E-mail: **********************通讯作者 李莉，女，主任中药师 E-mail: ****************收稿日期 2020-04-22 修回日期 2020-06-20
常州市食品药品监督检验中心，常州213000
摘 要 目的：建立HPLC 法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量# 方法：采用Poroshell 120 EC-C 18柱（4.6x 150mm ,4.0 !#）；流动相A 为乙腈，流动相B 为20%乙
腈水溶液（含0.08%十二烷基硫酸钠的2.4%冰醋酸），梯度洗脱；流量为1.0 #L • min -1 ；检测波长柚 皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为283 nm 、辛弗林为275 nm ；柱温为30 °C 。

结果：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮
苷和辛弗林的线性范围分别为5.035〜1007 !g ・mL -1、0.525〜104.9 !g ・mL -1、14.7〜2940 !g ・mL -1和
0.502〜100.3 !g-mL -1（r !0.999 8）o 4种成分的平均回收率在93.9%〜98.7%。

结论：该方法简便、准
确、灵敏、重复性好，可用于测定代代花4种成分的含量。

关键词 代代花；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；辛弗林；高效液相色谱
中图分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号1673-7806（2020）04-263-04
代代花,又名枳壳花、酸橙花、香橼花,为芸香 科植物代代花 Citrus aurantium L. var. amara Engl. 的干燥花蕾，是药食同源之品。

其成熟果呈橙红色,
留于树上至次年夏变为污绿色,状如回生，故其果
又名回青橙、回春橙。

“代代”即谓其可回生续代。

5~
6月花未开放时分批采摘，及时干燥。

以完整、色黄
白、香气浓者为佳。

主产于江苏、浙江等省。

味甘、微 苦，平，归肝、胃经。

具有理气、宽胸、开胃的作用，主 要用于胸脘胀闷、恶心呕吐、食欲不振［1-3］o
代代花中含有丰富的挥发油和柚皮苷、橙皮
苷、新橙皮苷、构椽皮素等黄酮类及!-甲基酪胺、 辛弗林等生物碱成分,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、 抗病毒、促进胃肠蠕动等药理作用I"264。

除有文献报 道对其干花的挥发油进行过研究外， 而对黄酮类、
生物碱成分的研究也仅局限于其果实枳壳［7,8］。

为完 善代代花的含量分析,保障药材质量,本文建立了
高效液相色谱法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮 苷、新橙皮苷、辛弗林的含量$
1仪器与药品、试剂
1.1仪器
Waters2695高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）
及Waters Empower 色谱工作站（美国沃特世公司）；
XP105DR 十万分之一电子天平（美国Mettler 公司）。

1.2药品与试剂
5批代代花购于市场,分别产自徐州、常州、苏
州、南通，均经江苏省炮制规范修订专家组（中国药 科大学余伯阳教授、中山植物园徐增莱教授、江苏 省中医院朱育凤主任）鉴定确认。

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林对照品（分 别为:批号 110722-201613,纯度 94.3% ； 110721-
201310,纯度 96.1% ；111857-201102,纯度 99.6% ；
110727-201608,纯度99.9%（均购自中国食品药品 检定研究院$甲醇、乙腈为色谱纯；冰醋酸、十二烷
基硫酸钠为分析纯;水为超纯水。

2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Poroshell 120 EC-C 18（4.6mm x 150mm ,
4.0 |!m ）；柱温：30 "；流速：1.0 mL-min -1； DAD 检测
器，进样量10 !L $流动相A 为乙腈，流动相B 为
20%乙腈水溶液（含0.08%十二烷基硫酸钠的2.4% 冰醋酸），梯度洗脱（0~15min ,0%~10%A ；15~20min ,
10%~60%A ；20~25 min ,60%~0%A ）$ 检测波长：柚皮 苷、橙皮苷、新橙皮苷为283nm ，辛弗林为275nm 。

2.2对照品溶液的制备
分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、辛弗林
HPLC法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量
对照品适量，置于同一100mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为1.007、0.1049、2.940"0.1003mg-mL-1的对照品贮备液。

分别精密量取对照品储备液5mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀,即得混合对照品溶液。

每1mL分别含柚皮苷0.1007mg、橙皮苷0.01049mg、新橙皮苷0.2940mg、辛弗林0.01003mg。

冷藏，备用。

2.3供试品溶液的制备
取代代花细粉0.1g,精密称定，置锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称重,加热回流lh,放冷,加入50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45!m微孔滤膜过滤，取滤液即得$
2.4系统适用性与专属性
取混合对照品溶液、供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进样测定，结果见图1$
图1高效液相色谱图
（A）混合对照品色谱图；（B）供试品色谱图；（C）空白溶剂色谱图
1.柚皮苷$
2.橙皮苷；
3.新橙皮苷；
4.辛弗林
由图1可知,4种成分色谱峰分离度良好（分离度〉
1.5）,且均可通过DAD纯度检测。

方法专属性良好。

2.5线性与范围
分别精密吸取“2.2”对照品贮备液1mL至2+ 5、10、20、50、100、200mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.1”色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积值（！）-进样浓度（#,mg-mL/1）进行线性回归（n=8）,得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的回归方程（相对偏差、线性范围）分别为：！=1.580x 107#-2.771"104（%=1.0000,5.035-1007!g-mL/1）；r= 1.728x107#-978.1（%=1.0000,0.5250-104.9^g-mL-1）；!=1.852x107#-5.832x104（%=1.0000,14.70-2940!g-mL-1）；!=4.025x105#-196.8（%=0.9998,0.5020-100.3!g•mL-1）o
2.6定量限考察
将对照品储备液用50%甲醇进行多次等倍稀释,信噪比S/N为10时,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林最低定量限分别为0.5035、0.5512、0.5250+0.502|xg・mL-1。

2.7进样精密度试验
精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10^L,按“2.1”色谱条件测定，重复进样6次，记录峰面积*结果显示,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的峰面积RSD值分别为0.2%、0.2%、0.1%、0.2%,表明仪器精密度良好*
2.8重复性试验
取1批代代花（产地：苏州,批号151014）6份,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液及供试品溶液10!L,按“2.1”色谱条件测定,用外标法测定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。

结果显示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的RSD值分别为0.5%、0.7%、0.6%、0.7%,表明方法的重复性良好*
2.9稳定性试验
取1批代代花（产地:苏州,批号151014）,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别在0、12、24、36、48h按“2.1”项下色谱条件取10^L进样,测定各成分的峰面积*结果显示,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林峰面积的RSD值分别为0.3%、0.5%、0.2%、0.5%,表明供试品溶液在48h内稳定*
2.10加样回收率试验
取同一批已知含量的代代花（产地：苏州,批号151014）6份,每份精密称取50mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密加入柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林浓度分别为50.35、10.49、147、10.03!g・mL-1的混合对照品溶液25mL及50%甲醇25mL,按“2.1”色谱条件进样,分别测定其峰面积,用外标法计算加样回收率和RSD,结果见表1*
2.11样品测定
取5批代代花，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液及供试品溶液10!L,按“2.1”色谱条件测定，用外标法分别计算含量,结果见表2*
3讨论
3.1代代花属芸香科植物酸橙的变种，参考《中国药典》与枳实同属,提取物代表成分为黄酮类的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和生物碱类的辛弗林，因此
柚皮昔
橙皮昔
新橙皮昔
辛弗林
300
400
300
400
300
400
300 400 (nm)
表1加样回收率试验结果(«=6)
成分样品中的量(mg )加入量(mg )测得量(mg )回收率(%)
平均回收率及RSD[%(%)]
柚皮8 1.647 2、1.6403、1.657 1、 1.258 8
2.857 2、2.8314、2.881 1、96.13、94.62、97.24、95.7(1.0)1.6508、1.6528、1.6485
2.853 2、2.857 1、2.840 895.52、95.67、94.72橙皮80.251 1、0.2500、0.2526、0.2622
0.5064、0.5013、0.503 5、97.35、95.81、95.67、97.0(1.2)0.2516、0.2520、0.2513
0.504 8、0.508 4、0.509 8
96.53、97.89、98.57
新橙皮8
3.058 4、3.045 6、3.076 7、 3.675 0
6.707 2、6.6424、6.755 1、99.29、9
7.87、100.09、9
8.7(0.9)3.0661、3.068 8、3.060 8
6.688 3、6.700 8、6.654 898.59、98.83、9
7.79
辛弗林
0.3315、0.3301、0.333 4、0.250 8
0.5613、0.566 8、0.568 7、91.66、94.41、93.83、93.9(1.3)
0.3322、0.3326、0.3317
0.5703、0.5701、0.566 8
94.96、94.73、93.75
表2样品含量测定(«=3)
产地批号
柚皮8(%)橙皮8(%)
新橙皮8(%)
辛弗林(%)
南通
150629 3.31
0.44 5.340.68常州20130313
3.02
0.39 5.070.55
苏州151014
3.280.50
6.090.66
徐州20140410
3.53
0.48 5.740.61
苏州
150325 3.50
0.48
5.77
0.63
图2紫外吸收光谱图
213.2
283.0A
284.2
223.8
283.0
328.3
•'
\ 327.1
h 5
本研究同时使用上述对照品为指标，对代代花的质
量进行了评价。

通过对水#50%甲醇#70%甲醇、甲醇 等溶剂的考察,发现使用50%的甲醇作为溶剂，样 品的提取效率高,在对照品色谱图中,色谱峰峰形
对称，理论塔板数高，分离效果好。

通过考察超声、回
流等不同提取方法及提取时间，发现加入50%甲醇
50mL ，加热回流lh ,效果最佳，基本可以提取充分，
且加样回收试验也验证了方法的准确性。

3.2由于辛弗林属于生物碱类物质，极性较强，在 一般液相条件下呈现极弱的保留，即使更换不同品 牌、性质的色谱柱(如Agilent 公司的ZORBAX SB-
C 18#Poroshell 120； Waters 公司的 XBridgeTM C 18；岛
津公司的 Inertsil ODS-SP ；Thermo 公司的 Syncronis
C 1W )仍然得不到很好的分离。

经过摸索，发现流动相
中加入0.1%十二烷基硫酸钠，同时使用梯度洗脱可 以使辛弗林的保留时间明显延后，并且不影响柚皮
苷、橙皮苷、新橙皮苷的分离。

在上述色谱柱上均可 以使测定组分满足分离要求。

3.3根据4种化合物紫外吸收波长的差别，并参照
《中国药典》柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在283nm 、辛 弗林在275 nm 有明显吸收，且杂质干扰少，故利用
二极管阵列检测器的实时扫描功能，获得所有波长
下的色谱图及即时的色谱图，从而达到同时测定4 种成分含量的目的。

见图2。

3.4由于收集的样品来自饮片市场，多见隔年货或 陈货(该品为少用中药&，但是通过实验发现，柚皮
苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林不仅含量较高，而且 含量相对稳定，故可作为质量控制的指标。

3.5近些年来，研究者对生物类黄酮进行了大量的 研究。

其是自然界中存在的酚类物质，属植物的次 级代谢产物，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧
化、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。

代代花中含有的黄 酮类含量高于同科其他植物，其中橙皮苷、柚皮苷
具有抗炎作用；所含的生物碱主要是辛弗林、N -甲
基酪胺等，是升高血压、抗休克的主要有效成分。

未 来开展代代花在食疗、治疗抑郁及代代花茶饮品方
面会有较大的发展空间，为综合利用代代花的资 源，很有必要对其开展深入系统性研究。

参考文献
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(下转第269页)
检测黄芪甲苷含量的较好方法A51。

比较了甲醇-水、乙腈-水等不同流动相系统，当采用乙腈-水(35：65&时，各成分能达到基线分离,黄芪甲苷的峰型好、理论板数高，因此选用乙腈-水(35：65)作为流动相。

为进一步检测所得试验数据的准确性，比较分析了不同水饱和正丁醇溶液提取次数(3~6次)对于样品黄芪甲苷含量测定的影响，结果发现,3次提取与4次提取所得黄芪甲苷的含量存在较大的差异,然而继续增加提取次数，所得黄芪甲苷的含量未呈现明显的递增趋势。

为能完全地提取黄芪甲苷，同时尽可能节约试验资源，故将水饱和正丁醇溶液作为提取试剂，以提取4次为佳。

顺势康胶囊含有药味较多，成分复杂，本研究所建立的黄芪甲苷测定方法结果稳定，专属性强，可有效地控制该药品的质量#
参考文献
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Study on the Method of Identification and Content Determination of Shun-shikang Capsule
HANG Juan,JIN Li,ZHANG Xinyue,BU Ying,ZHANG Xiaodan*
Wuxi Joint Logistics Support Centre^Drug Instrument Supervision and Inspection Station^Nanjing210002 ABSTRACT Objective:To establish a method for the identification and content determination of Shunshikang capsules.Methods：Radix Astragali,Ephedra and Liquorice were identified by TLC qualitatively.The content of astragaloside iv in Radix Astragali was determined by HPLC-ELSD.Results：The spots in TLC were clear,the separation was good,and the negative control preparation had no interference.The linear range of astragaloside iv in HPLC determination was50.24-251.2|!g*mL-1,r=0.9993 (n=5),the average recovery rate was97.76%and the RSD was 2.35%.The average content of astragaloside iv was between0.0812mg/pill and0.0928mg/pill in three batches of capsules.The minimum content of astragaloside iv in this product should not be less than0.050mg/pill.Conclusion：The method established in this paper is accurate and reliable,and can effectively control the quality of this preparation.
KEY WORDS Shunshikang Capsule;Quality standard;TLC;HPLC-ELSD;Astragaloside
(上接第265页)
Determination of Naringin,Hesperidin,Neohesperidin and Synephrine in Flos Aurantii Amarae by HPLC
CHENG Chen,LI Li*
Changzhou Institude for Food and Drug Control：Changzhou^213000：China
ABSTRACT Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of the contents of naringin,hesperidin,neohesperidin and synephrine in Flos Aurantii Amarae.Methods：The analysis was conducted on a column of Agilent Poroshell120EC-Cn(4.6mm x150mm,4|!m)at30",using3% acetic acid(including0.1%SDS)-acetonitrile in a gradient elution mode as the mobile phase with the flow rate at 1.0mL*min-1.The detection wavelength were set at283nm for naringin,hesperidin and neohesperidin,and275nm for synephrine.Results：The linear ranges of naringin,hesperidin,neohesperidin and synephrine were 5.035-1007|!g*mL-1,0.525-104.9|!g*mL-1,14.7-2940|!g*mL-1and0.502-100.3|!g*mL-1 (r!0.9998),respectively.The average recoveries were between93.9%-98.7%.Conclusion：The method is accurate,simple and convenient with good repeatablility,which can be used for quality control of Flos Aurantii Amarae.
KEY WORDS Flos Aurantii Amarae;Naringin;Hesperidin;Neohesperidin;Synephrine;HPLC。