SIRT1对早期脑缺血大鼠水通道蛋白4表达的影响

SIRT1对早期脑缺血大鼠水通道蛋白4表达的影响
贺伟;展宏刚
【摘要】目的:检测水通道蛋白4(AQP4)及沉默信息调节因子1(SIRT1)在脑缺血大鼠脑组织中的表达变化,探究SIRT1对AQP4的调节作用,明确二者在脑缺血及脑水肿发生发展中的作用.方法:雄性SD大鼠随机分成假手术组(sham组)和脑缺血模型组(MCAO组),其中MCAO组又分为6 h、12 h、24 h和48 h 4个时点组别.采用线栓法阻塞大脑中动脉建立局灶性脑缺血模型,于相应时点进行神经症状评
分,Morris水迷宫检测大鼠学习认知功能,TTC染色观察脑梗死体积,干湿重法检测脑含水量的变化,HE染色观察大脑皮层周围组织神经细胞形态学变化,Western blot检测AQP4、SIRT1和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达情况.结果:与sham 组相比较,随着再灌注时间增加,MCAO组大鼠神经功能评分、脑梗死体积、脑组织通透性和脑组织含水量均持续增加,而大鼠学习认知功能则降低显著,HE染色显示脑缺血大脑皮层周围组织神经元细胞形态不规则,数目减少;Western blot实验结果显示AQP4表达水平呈增高趋势,SIRT1表达降低,MMP-9表达增高,MCAO-48 h 组与sham组比较差异最明显(P<0.01).结论:脑缺血后,伴随脑组织损伤的加
剧,SIRT1和MMP-9信号通路的表达激活影响了AQP4的表达活化,共同参与了脑水肿的形成.%AIM:To investigate the pathological changes of aquaporin 4 (AQP4) and related proteins in the rats with focal cerebral ischemia injury , and to observe the effect of silent information regulator 1 ( SIRT1) on the AQP4 ex-pression in order to explore the pathological mechanism of cerebral ischemia and brain edema .METHODS: Adult male SD rats were randomly divided into sham group and middle cerebral artery occlusion ( MCAO) model group.The MCAO model group was divided into the 4 time
point (6 h, 12 h, 24 h and 48 h) subgroups.The animal model of MCAO was es-tablished by suture method in mature SD rats .The neural symptom score was measured at the corresponding time points . Morris water maze test was used to study the cognitive function .The cerebral infarction volume was evaluated by TTC stai-ning .The changes of brain water content was analyzed by a dry /wet weight method .The morphological changes of the brain tissues were observed under microscope with HE staining .The protein expression of SIRT 1, MMP-9 and AQP4 was deter-mined by Western blot .RESULTS: Compared with sham group , the neural function score of the rats in MCAO model group was significantly elevated .With the increasing reperfusion time , the cerebral infarction volume , brain tissue permea-bility and the brain water content were also increased .The increases in the protein levels of AQP 4 and the related proteins showed apparent changes .The protein expression of SIRT 1 was decreased , while the MMP-9 expression was increased .The most obvious differences of the protein level changes in MCAO-48 h model group were observed (P<0.01).CONCLU-SION:Accompanied with the aggravating cerebral injury after cerebral ischemia , the process of AQP4 expression is activa-ted with the increasing expression levels of MMP-9 and SIRT1.These factors are combined to induce the formation of brain edema.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2017(033)003
【总页数】7页(P455-461)
【关键词】脑缺血;脑水肿;沉默信息调节因子1;水通道蛋白4
【作者】贺伟;展宏刚
【作者单位】山东省泰山医院,山东泰安271000;山东省泰山医院,山东泰安271000
【正文语种】中文
【中图分类】R363.2
脑缺血可发生于多种脑血管疾病过程中，涉及多环节、多因素、多途径损伤的复杂酶促级联反应，引起严重的神经损伤。

而脑水肿是缺血性脑血管病中常见的并发症之一，引起颅内高压、加重病情，甚至造成病人死亡。

而血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性改变既是脑缺血损伤后的结果，又是导致损伤进一步加重的重要因素[1]。

水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)是膜水通道蛋白家族的一员，在脑组织中广泛表达，是控制水进出脑组织的通道，在脑组织水平衡、星形细胞迁移、神经兴奋及炎症等方面均起着重要作用[2]。

大量研究[3]表明，AQP4与脑水肿关系密切，参与了多种疾病所引起的脑水肿的病理过程。

先前的大量研究[4]显示，脑缺血早期，迅速引起脑损伤，损伤程度随时间变化很大，这一时期所造成的脑水肿程度也最为严重。

更有研究[5]指出，中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)发生48 h之内是脑水肿的发展的关键时期，也是临床药物治疗的黄金时期。

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)为哺乳动物sirtuins家族成员之一，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的去乙酰化酶，在成人组织中广泛表达。

研究显示，SIRT1通过去乙酰化相关因子调节基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在内的多个细胞信号通路，参与心脑血管内皮细
胞保护作用[6]；另有研究显示，MMP-9信号通路可以激活AQP4的表达，参与
心血管疾病的发生过程[7],但在脑缺血后继发脑水肿病理生理过程中的作用仍不清楚。

为了进一步研究脑缺血发生早期SIRT1、MMP-9信号通路与AQP4的表达存在具体的病理生理关系，我们建立大鼠MCAO模型，选取了MCAO 6 h、12 h、24 h及48 h这4个重要的时点分别进行研究，以期探寻大鼠脑缺血后早期SIRT1对水通道蛋白4的调控规律及其与脑水肿的关系。

水合氯醛(中国医药)；0.9%氯化钠注射液(湖南科伦制药)；生物素标记山羊抗兔IgG/小鼠IgG Ⅱ抗试剂盒(北京中杉金桥生物)；Western blot Ⅰ抗Ⅱ抗去除液、Western blot 转膜液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购自碧云天生物；蛋白markers(Lonza Rockland)；PVDF
膜(0.45 μm；购自SERVA)；增强型化学发光试剂(Millipore)；所用单克隆抗体为AQP4(Abcam)、MMP-9(Cell Signaling Technology)、SIRT1(LifeSpan)和β-actin(Ambobio)。

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF级，体重250～300 g，由山东省医学科
学院动物中心提供，合格证号为SCXK(鲁)2016-0007。

应用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理，数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差异有统计学意义。

实验期间，sham组大鼠一般状态良好，对外界反应灵敏，无死亡。

与sham组比较，MCAO组大鼠精神萎靡，出现运动功能障碍，行走向对侧旋转或倾倒，甚至
瘫痪。

Sham组造模全部成功，MCAO模型组造模成功71只，成功率约80.0%。

Sham组未闭塞大脑中动脉，故评分均为0分；造模后MCAO模型组神经功能评分如表1，表明各模型组均出现不同程度的神经功能缺损症状，随着再灌注时间延长，自6 h～48 h神经功能评分呈逐渐增高趋势；与MCAO-6 h组比较，
MCAO-24 h及MCAO-48 h组神经功能评分差异有统计学显著性(P<0.05)。

与sham组比较，MCAO组大鼠逃避潜伏期逐渐延长，穿越平台次数减少，探索速度及平台象限路程百分比降低，探索路程增加。

MCAO组间比较，随着缺血时间延长，MCAO-48 h组逃避时间延长明显，差异具有统计学显著性(P<0.01)；与MCAO-6 h组比较，24 h及48 h时点均显著降低，差异具有统计学显著性
(P<0.05)；探索速度均降低，尤其在MCAO-48 h组降低最为显著(P<0.01)；平台象限路程百分比降低，探索路程增加(P<0.05)，MCAO-48 h组增加最显著(P<0.01),见表1、2。

4 大鼠血脑屏障通透性的变化
实验结果如表1所示，EB染色范围反映了大鼠血脑屏障通透性。

MCAO组与假手术组相比，血脑屏障通透性显著增加(P<0.01)；随着时间的持续，与MCAO-6 h 组相比较，MCAO-24 h及MCAO-48 h组脑组织均显著增加血脑屏障通透性(P<0.05)，而MCAO-12 h与MCAO-6 h组相比较略有增加，但相互之间无显著差异。

实验结果如图1所示，sham组各时点脑组织含水量都维持在较低的正常水平，组间变化不大，相互之间差异无统计学显著性；与sham组相比较，MCAO组各时点的脑含水量显著增加；随着再灌注时间延长，各组脑含水量均逐渐升高，尤其在MCAO-12 h组脑含水量显著激增，与MCAO-6 h组比较，差异有统计学显著性(P<0.05)；MCAO-24 h及48 h组的脑含水量均维持在较高的水平。

与假手术组相比，缺血再灌注各组脑组织梗死范围从再灌注6 h逐渐升高
(P<0.05)，再灌注48 h达到峰值，差异有统计学显著性(P<0.01)。

假手术组无缺血改变，TTC 染色呈均匀红色。

MCAO 组梗死体积百分比随再灌注时间的延长逐渐增加(P<0.05)，在48 h达到最大，见图2。

7 光镜检查
光镜下大脑海马组织HE染色可见，sham组神经元和胶质细胞形态正常，CA1区神经元排列整齐、均匀，无间质水肿。

MCAO组缺血周边大脑组织结构水肿明显，神经元、胶质细胞细胞数目锐减，细胞间隙增宽，神经纤维网呈空泡样变，随着缺血时间增加，神经元胞浆及胞膜形态不规则，边界不清，胞核浓缩程度加重，部分细胞肿胀显著；尤其在缺血48 h前后，神经元胞体体积明显增大，细胞水肿显著，见图3。

8 Western blot检测MCAO大鼠脑组织相关蛋白表达
Western blot条带及灰度定量分析结果可见，MCAO模型组各时点AQP4蛋白
表达升高，其中MCAO-24 h及48 h蛋白表达升高显著，与sham组存在显著性差异(P<0.01)；与MCAO-6 h组相比较，MCAO-24 h及48 h组，AQP4蛋白
表达增加显著(P<0.05)，MCAO-12 h组表达增加不显著，见图4。

MCAO模型组各时点MMP-9蛋白表达持续升高，与sham组差异存在统计学显著性(P<0.05)；与MCAO-6 h组相比较，MCAO-12 h及24 h组MMP-9蛋白
表达量略有增加，差异无统计学显著性，MCAO-48 h组MMP-9蛋白表达水平
增加显著(P<0.05)，见图5。

如图6结果所示，sham组的SIRT1蛋白呈较高水平表达，MCAO模型组中，随
着缺血时间的延长，SIRT1蛋白表达水平持续降低。

与sham组比较，MCAO-12 h、24 h及48 h组SIRT1蛋白表达水平均降低显著，差异存在统计学显著性
(P<0.05)；MCAO-6 h组降低不明显；与MCAO-6 h组相比较，MCAO-24 h及48 h组的SIRT1蛋白表达均显著降低，差异具有统计学显著性(P<0.05)；MCAO-12 h组SIRT1的表达水平略有降低，但差异无统计学显著性。

缺血性脑损伤过程中，除缺氧和能量代谢衰竭外，由缺血诱导的一系列瀑布样效应是导致神经元死亡的重要机制[10]。

AQP4是膜水通道蛋白家族的一员，在脑组织
中广泛表达，是控制水进出脑组织的通道，在脑组织水平衡、星形细胞迁移、神
经兴奋及炎症等方面均起着重要作用[11]。

SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的蛋白去乙酰化酶类，在抑制炎症级联反应，抑制氧化应激，调节内皮细胞稳态，介导基因组沉默，减少蛋白表达、代谢及能量消耗，抑制细胞凋亡等途径发挥神经保护作用[12-13]。

在大鼠脑缺血模型中，白藜芦醇通过增加SIRT1的活性实现对缺血预处理大鼠模型海马CA1区神经元的保护作用[14]；先前研究发现，SIRT1
参与了肺泡巨噬细胞对MMP-9表达的调控作用，进而在慢性阻塞性肺病的发生
发展中起保护性作用[15]。

MMP-9是脑缺血后过度表达的炎症因子。

研究证实，MMP-9可以通过降解闭合蛋白(occludin)等紧密连接蛋白，导致血脑屏障通透性增加[16-17]。

更有研究证实[7]，在脑缺血早期，MMP-9可以通过调节AQP4的表达水平，参与脑水肿的发生过程。

但是在脑缺血的早期发生发展过程中，SIRT1、MMP-9及AQP4的变化仍鲜有探讨。

本实验结果显示，MCAO模型大鼠各时点神经功能评分都增加，且随着时间延长，神经功能评分也就越高，学习认知能力也不断降低；随后的脑组织取材研究中也显示，无论是脑组织含水量还是脑梗死体积分数都随着时间的延长而进行性加重。

HE染色选取海马脑组织观察，显示神经细胞水肿进行性加重。

本研究通过免疫组化及Western blot等技术手段研究缺血区AQP4蛋白的表达水平及脑组织分布特征，结果表明AQP4蛋白表达水平随着时间的延长迅速的增加，在MCAO-48 h达到最大表达水平。

伴随着脑水肿程度加重，AQP4蛋白的表达
增强，这一结果表明AQP4的表达变化与MCAO模型脑水肿的形成密切相关。

为进一步阐明脑水肿发生过程中TJPs表达降低的具体病理生理过程，我们检测了MMP-9蛋白的表达水平。

结果显示MCAO后随着脑损伤的加剧，MMP-9的表
达也是相伴增加的。

而SIRT1蛋白在MCAO模型早期则显示出持续降低的表达水平。

由此，我们推测MCAO后伴随着脑组织损伤而产生的脑水肿可能是因为在缺血状态下SIRT1信号分子表达受到抑制，对MMP-9蛋白表达抑制作用减弱，引起MMP-9的过表达，破坏了血脑屏障的结构与功能，引发后续信号通路中AQP4蛋白的表达增加，使得脑组织水及电解质转运紊乱，各种炎性介质也随之进入脑组织，从而导致脑水肿的发生与不断的发展。

本部分研究内容从分子角度初步探究了脑缺血及其继发脑水肿早期的病理生理过程，为进一步药物干预研究提供了研究基础和理论依据，也为临床预防和治疗脑水肿提供重要的参考。