《动物的克隆》PPT课件
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2.2 受体胞质的选择和处理
2.2.1 卵母细胞在动物克隆中的作用
在克隆中，供核细胞的全能性是基础，但这种全能性 只有在特定的条件下才能实现。这一特定条件就是卵 母细胞。研究发现：早期胚胎的发育首先是由母型信 息调控（maternal regulation）的，直到合子型基因 被 激 活 ， 才 能 过 渡 到 合 子 型 调 控 （ zogotic regulation）。也就是要经过由母源控制向合子型控 制胚胎发育的转变（maternal-zygotic transition, MZT）。
目前一般以排出第一极体作为卵母细胞成熟 的标志。
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2.2.5 卵母细胞的激活
成熟后的卵母细胞停滞于MⅡ期，自然条件下， 当精子穿入（受精）后会激活卵母细胞，启动一 系列生化事件和形态变化。
面对问题：核移植胚是怎样被激活的？
解决途径：
途径一：电激活。电脉冲剌激是最经典、应用最 为广泛的卵母细胞激活方式。细胞膜在瞬间高压 电流脉冲的作用下，激发穿孔，从而使细胞内外 的离子和大分子物质发生短暂流动，其中钙离子 的内流会导致卵母细胞活化。
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途径二：化学物质激活。包括乙醇、钙离子载 体A23187（Calcium ionophore A23187, CaA）、 离 子 霉 素 （ Ionomycin）、Sr2+、 Thimerosal(THI) 、Dithiothreitol(DTT)、三 磷 酸 肌 醇 、 精 子 因 子 （ sperm factor, SF） （精子的提取物）。
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1938年，Hans Spermann提出了克隆动物的设想：从一 个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受 精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克 隆的思想，但一直未能付诸实施。
选修3 动物的克隆(75张PPT)
3.动物细胞培养和组织培养的联系
两者在一定程度上可看作是同义语，统称为组织培养 （组培），即代表各种生物体结构成分的体外培养。
广义的组织培养还包括器官培养，即器官的原基、器 官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保 存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力。
动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞，
• 选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者 次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT－）缺陷。
• 筛选的方法： 用选择性培养基来完成，即HAT培养基。加入次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称HAT培养基。
• 其中，氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应 急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶） 作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成 不能发生。
5. 大部分细胞是贴壁细胞，需要一个可贴附的表面【细胞培养瓶或卡氏瓶的壁，培养 皿的壁】，会接触抑制，培养密度不能过大。 少部分细胞是悬浮细胞，悬浮培养，悬浮细胞的密度可远远大于贴壁细胞，因此利用 动物细胞进行工业大规模生产一些药物时，最好使用悬浮细胞。
（3）动物细胞的培养过程
取动物胚胎 或幼龄动物器官
正常细胞
接触抑制
癌细胞
（2）动物细胞培养的条件
1）离体
2）营养物质：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、
动物血清
3）恒温和pH，无需光照 4）无菌无毒的环境
保证细胞顺利 的生长增殖
培养条件：
1. 培养基营养物质：氨基酸、糖类、维生素、无机盐、激素、其他成分（生长因子 【添加动物血清】）
2. 气体：CO2 O2【 CO2 培养箱：5% CO2和95%的空气 ，培养时培养瓶的盖子 处于拧松状态】 CO2的作用：调节PH 3. 理化条件：PH【 5% CO2调节PH ，培养基中加入PH缓冲剂，培养过程中细胞代 谢产生很多酸性物质，PH发生改变，为了实时监控培养基中PH的变化，一般在培养 基中加入酚红指示剂，若培养基颜色变化超过一定程度，即使细胞密度不大，也要更 换培养基。 】、渗透压、温度、湿度【 CO2 培养箱：37℃，湿度很高】 4. 无菌条件
动物克隆技术PPT课件
目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能 肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物 或其它不同组织器官的细胞。
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2020/1/16
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（2）遗传、疾病问题
克隆动物夭折率高，不少克隆动物天 生患有疾病或体形过大。
克隆动物没有遗传物质的交流和互补， 将会加剧一些遗传疾病的发生。
24
（3）社会、伦理学问题
将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6 天后发育成桑椹期胚胎或囊胚（8－16个细 胞），再移入假孕母羊子宫内。
产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。
16
使用最多的克隆方法 ——胚胎细胞克隆
17
18
3.克隆的基本过程
动物克隆技术的核心是核移植。 核供体动物的选择与细胞核的获得。 核受体动物的选择与细胞核的移出。 供体核的移入及原核的取出。 胚泡的体外试管培养。 代母的选择与胚泡移入子宫。 克隆动物的体内发育与出生。
5
世界10年克隆研究之路
1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利” 诞生 1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。 1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。
一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠 2000年 曾参与克隆“多利” 羊的英国公司培育了第一
批克隆猪 2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。 2002年 法国研究人员克隆出兔子2003年 美国科学家
注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面 母绵羊）排卵，28－33小时取其未受精卵 快速去核，放入10%FCS（小牛血清）、 1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入 G0期做受体细胞。
15
在乳腺细胞注射GN34－36小时后与无核 卵放入同一培养皿中，在微电流作用下， 将乳腺细胞核融入卵中，形成一个含有新 遗传物质的卵细胞。
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（2）遗传、疾病问题
克隆动物夭折率高，不少克隆动物天 生患有疾病或体形过大。
克隆动物没有遗传物质的交流和互补， 将会加剧一些遗传疾病的发生。
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（3）社会、伦理学问题
将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6 天后发育成桑椹期胚胎或囊胚（8－16个细 胞），再移入假孕母羊子宫内。
产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。
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使用最多的克隆方法 ——胚胎细胞克隆
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3.克隆的基本过程
动物克隆技术的核心是核移植。 核供体动物的选择与细胞核的获得。 核受体动物的选择与细胞核的移出。 供体核的移入及原核的取出。 胚泡的体外试管培养。 代母的选择与胚泡移入子宫。 克隆动物的体内发育与出生。
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世界10年克隆研究之路
1996年 第一只成年体细胞克隆羊“多利” 诞生 1997年 一头用胎盘克隆而成的荷兰牛亮相。 1998年 两头由母牛细胞克隆而成的小牛在东京出生。
一个国际研究小组宣布克隆出了三代实验鼠 2000年 曾参与克隆“多利” 羊的英国公司培育了第一
批克隆猪 2001年 一头稀有品种的克隆亚洲牛诞生，两天后死亡。 2002年 法国研究人员克隆出兔子2003年 美国科学家
注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面 母绵羊）排卵，28－33小时取其未受精卵 快速去核，放入10%FCS（小牛血清）、 1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入 G0期做受体细胞。
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在乳腺细胞注射GN34－36小时后与无核 卵放入同一培养皿中，在微电流作用下， 将乳腺细胞核融入卵中，形成一个含有新 遗传物质的卵细胞。
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转入特殊培养液 中进行原代培养 细胞形成生长晕并增大
分装到多个卡氏瓶中进 行传代培养
a
4
有关概念:
细胞系— 可连续传代的细胞
（1）有限细胞系： 不能连续培养下去的细胞系 例：二倍体细胞
（2）连续细胞系: 能连续培养下去的细胞系
发生了转化：大多数具有异倍体核型，有的
是恶性细胞系，具有异体致瘤性，有的获得 不死性（保留接触抑制，不致癌）
克隆羊多利
a
14
讨论（阅读P36-37）
体细胞羊的克隆成功证明了什么？
为什么克隆羊能获得成功，请用分子细胞学机理来阐述 原因。
克隆动植物具有哪些应用？
a
15
专能干细胞：
低等动物细胞的全能性一般比较容易体现。
无论分化或癌变，变化的都是表现型，基因组完整性可以保留
a
11
2.动物难以克隆的原因
细胞的分化使得细胞发生了基因的差异表达， 有的基因开放，有的基因关闭 已分化的体细胞，基因组中基因的活动很不 完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性
a
12
3.动物核移植实验和克隆繁殖
细胞株-
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细胞 系中获得的具有特殊性质的细胞
有限细胞株 连续细胞株
具有恒定的染色体组型、同工酶类 型、病毒a 敏感性和生化特性。 5
细胞系与细胞株的关系
细胞系泛指可传代的细胞 细胞株是具有特殊性质的细胞系
a
6
（3）动物组织培养的条件:
1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH 4.气体环境
2、产物: 遗传性状均一、表现的性状相似的纯系
未经克隆的异质性细胞系 分离 克隆
纯系：经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源 于一个共同的祖细胞。
分装到多个卡氏瓶中进 行传代培养
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有关概念:
细胞系— 可连续传代的细胞
（1）有限细胞系： 不能连续培养下去的细胞系 例：二倍体细胞
（2）连续细胞系: 能连续培养下去的细胞系
发生了转化：大多数具有异倍体核型，有的
是恶性细胞系，具有异体致瘤性，有的获得 不死性（保留接触抑制，不致癌）
克隆羊多利
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讨论（阅读P36-37）
体细胞羊的克隆成功证明了什么？
为什么克隆羊能获得成功，请用分子细胞学机理来阐述 原因。
克隆动植物具有哪些应用？
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专能干细胞：
低等动物细胞的全能性一般比较容易体现。
无论分化或癌变，变化的都是表现型，基因组完整性可以保留
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2.动物难以克隆的原因
细胞的分化使得细胞发生了基因的差异表达， 有的基因开放，有的基因关闭 已分化的体细胞，基因组中基因的活动很不 完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性
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3.动物核移植实验和克隆繁殖
细胞株-
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细胞 系中获得的具有特殊性质的细胞
有限细胞株 连续细胞株
具有恒定的染色体组型、同工酶类 型、病毒a 敏感性和生化特性。 5
细胞系与细胞株的关系
细胞系泛指可传代的细胞 细胞株是具有特殊性质的细胞系
a
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（3）动物组织培养的条件:
1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH 4.气体环境
2、产物: 遗传性状均一、表现的性状相似的纯系
未经克隆的异质性细胞系 分离 克隆
纯系：经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源 于一个共同的祖细胞。
《动物克隆技术》PPT课件
1998年4月13日克隆羊多莉和公羊戴维进行正 常交配的后代——女儿邦尼诞生。邦尼的诞生 表明,克隆动物并没有丧失生殖能力。
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多莉和邦妮
14
1998年5月,美国科学家利用胎儿成纤维细胞克隆3 头牛,而且携带了转移的基因。
1998年7月Wakayama等成功地用小鼠的卵丘细 胞克隆和再克隆出小鼠,这是人类第一次用克隆动 物再克隆出克隆动物。
Wilmut博士等建立的一整套绵羊体细胞移植程 序,如恢复体细胞核全能性的“血清饥饿法”、 体细胞传代阶段的确定以及体细胞克隆后代与 亲本核供体间的DNA微卫星分析等技术,成为 全世界同行公认的哺乳动物细胞核移植的基本 程序。
10
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多莉和威尔穆特
12
此后,他们又用绵羊的胚胎细胞进行核移植实 验,成功地获得了整合有人凝血因子XI的转基 因绵羊,取名“波莉(Polly)”，这样波莉成年后 就可能在乳汁中大量表达昂贵的医用人凝血因 子XI。
17
2001年3月,英国产生 克隆绵羊“多莉”的 公司成功培育出5只
克隆小猪,期望用于人 体器官移植的研究。 五只克隆猪全为雌性， 最大的一只为Millie， 取 意 于 单 词 millenium （千禧）。
18
大老鼠难以复制， 2003年法国复制的名 为“拉尔夫（Ralph）” 的老鼠是第一只。
1986年,英国的Willadsen报道用早期的胚胎细 胞克隆出第一只羊。
此后,其他科学家相继成功地克隆出牛(1987)、 兔(1988)、猪(1989)。
1996年,Campbell等报告用培养传代的羊胚盘 细胞经无血清饥饿法使其进入G0期,移入卵母 细胞后可正常发育到产仔。
9
1997年2月,英国罗斯林研究所的Wilmut等利用 5岁绵羊的乳腺上皮细胞进行核移植试验,并成 功地获得了世界上第一只体细胞克隆绵羊“多 莉(Dolly)”,这是克隆技术的一个新的里程碑。
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多莉和邦妮
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1998年5月,美国科学家利用胎儿成纤维细胞克隆3 头牛,而且携带了转移的基因。
1998年7月Wakayama等成功地用小鼠的卵丘细 胞克隆和再克隆出小鼠,这是人类第一次用克隆动 物再克隆出克隆动物。
Wilmut博士等建立的一整套绵羊体细胞移植程 序,如恢复体细胞核全能性的“血清饥饿法”、 体细胞传代阶段的确定以及体细胞克隆后代与 亲本核供体间的DNA微卫星分析等技术,成为 全世界同行公认的哺乳动物细胞核移植的基本 程序。
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多莉和威尔穆特
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此后,他们又用绵羊的胚胎细胞进行核移植实 验,成功地获得了整合有人凝血因子XI的转基 因绵羊,取名“波莉(Polly)”，这样波莉成年后 就可能在乳汁中大量表达昂贵的医用人凝血因 子XI。
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2001年3月,英国产生 克隆绵羊“多莉”的 公司成功培育出5只
克隆小猪,期望用于人 体器官移植的研究。 五只克隆猪全为雌性， 最大的一只为Millie， 取 意 于 单 词 millenium （千禧）。
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大老鼠难以复制， 2003年法国复制的名 为“拉尔夫（Ralph）” 的老鼠是第一只。
1986年,英国的Willadsen报道用早期的胚胎细 胞克隆出第一只羊。
此后,其他科学家相继成功地克隆出牛(1987)、 兔(1988)、猪(1989)。
1996年,Campbell等报告用培养传代的羊胚盘 细胞经无血清饥饿法使其进入G0期,移入卵母 细胞后可正常发育到产仔。
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1997年2月,英国罗斯林研究所的Wilmut等利用 5岁绵羊的乳腺上皮细胞进行核移植试验,并成 功地获得了世界上第一只体细胞克隆绵羊“多 莉(Dolly)”,这是克隆技术的一个新的里程碑。
浙科版选修3第二章克隆技术第三节动物的克隆(第一课时)(26张PPT)
细胞生命力旺盛， 分裂能力强
动物细胞培养能否 像绿色植物组织培 养那样最终培养成 新个体？ 不能，动物细胞培 养只能使细胞数目 增多，不能发育成 新的动物个体
胰蛋白酶处理
分散了做成细胞悬 浮液利于细胞培养
单个细胞
细胞培养
1、动物细胞培养过程 取动物组织块 剪碎组织 用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞
放入CO2培养 箱中培养
细胞的全能性
细胞增殖 液体培养基
培养基性质
固体培养基
葡萄糖、动物血 蔗糖、植物激素 培养基特有成分 清 培养目的 培养结果
快速繁殖、培育 无病毒植株等 获得细胞 或细胞产物
新的个体或细胞 细胞或细胞产品 产品
如何获得纯系的细胞系？
采用细胞克隆
阅读教材P30-31页思考：
什么是克隆培养法。 克隆培养的细胞特征？ 细胞克隆的难易程度？ 细胞克隆的最基本要求是什么？ 如何提高细胞克隆形成率？ 克隆培养法的主要用途是什么？
维持培养液的PH
⑹较植物组织培养基有何独特之处？ 液体培养基、成分中有动物血清等
例题1：用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎 或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是 这样的组织细胞 （ ） A. 容易产生各种变异 B. 具有更强的全能性 C. 取材十分方便 D. 分裂增殖的能力强 例题2：动物细胞培养的特点（ ） ①细胞贴壁 ②有丝分裂 ③细胞分化 ④接触抑制 ⑤减数分裂 ⑥原代培养一般指初次培养 A. ①②④⑥ B. ②③④⑤ C. ①③④⑥ D. ③④⑤⑥
转入培养 液中进行 原代培养 细胞培养条件？
贴满瓶壁的细 胞用胰蛋白酶 处理分散成单 个细胞，制成 细胞悬液
转入培养液中 进行传代培养
原代培养
高中生物PPT课件动物克隆 (2)
产量低，抗体的特异性差，纯度低（具异质性）
科学家分析、探索过程：
1、体内B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异 性抗体； 2、每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 3、临床医学目标：获得大量的单一抗体 理论方法：用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是 通过克隆，形成细胞群，由该细胞群就能产生出单克 隆抗体（化学性质单一、特异性强的抗体） 4、遇到的难题：体外培养时，一个B淋巴细胞不可 能无限繁殖，无法得到大细胞群
细胞培养和细胞融合
二、动物的细胞融合技术及其应用
（一）细胞融合与细胞杂交
细胞A
细胞B
电融合 灭活的仙台病毒、聚乙二醇 原理： 细胞膜的流动性
基因型不同的细胞融合 就是细胞杂交 融合细胞 应用：基因定位，Why?
二、动物的细胞融合技术及其应用
（二）杂交瘤技术与单克隆抗体制备 1.传统获取抗体：
反复注射 某抗原 产生 抗体 血清中分离
培养目的
三、动物的克隆繁殖
克隆繁殖
体细胞
个体
三、动物的克隆繁殖
（一）动物细胞全能性的表现程度
个分组 体化织 ︑︑ 形器 成官
受精卵
多能干细胞
单能干细胞
高度分化细胞
三、动物的克隆繁殖
（二）动物难以克隆的根本原因：
基因的选择性表达
细胞分化使得细胞发生了基因的差异性表达， 有的基因开放，有的基因关闭。
二、动物的细胞融合技术及其应用
大胆设想： 小鼠骨髓瘤细胞：能在体外培养下大量增殖 某一B淋巴细胞：能产生特异性抗体
小鼠骨髓瘤细胞+某一种淋巴细胞
过程： 2.单克隆抗体制备：
二、动物的细胞融合技术及其应用
（二）杂交瘤技术与单克隆抗体制备
高中生物PPT课件《动物的克隆》第三课时 (1)
一、动物细胞全能性的表现程度
细胞全能性 指单个细胞具有发育成完整个 体的潜能。
受精卵具有全能性
一、动物细胞全能性的表现程度
• 2、“受精卵、多能干细胞、胚胎干细胞、 单能干细胞、高度分化细胞”请按细胞表 现全能性程度由高到低排序：
• 3、“低等动物细胞、高等动物细胞、植物 细胞”请按细胞表现全能性程度由高到低 排序：
一、动物细胞全能性的表现程度
2、 受精卵> 胚胎干细胞 > 多能干细胞 > 如多能造血干细胞： 单能干细胞 > 高度分化细胞 可分化为红细胞、 白细胞、血小板等 3、
植物细胞 > 低等动物细胞 > 高度动物细胞
培育过程
去核卵细胞 体细胞核
细胞核移植
动物难以克隆的 根本原因？
重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎(或重组胚胎） 胚胎移植 母体子宫 妊娠、出生 个体
二、动物难以克隆的根本原因
在动物的个体发育过程中，分化的结果使 得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细 胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变 化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的 蛋白质,使得基因组中基因的活动很不完全。
培育过程
去核卵细胞 体细胞核
细胞核移植
体细胞克隆动物成 功可以证明？
重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎(或重组胚胎） 胚胎移植 母体子宫 妊娠、出生 个体
体细胞克隆动物成功可以证明：
1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类 似受精卵时期的功能。 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作 用。
三、体细胞克隆猴成功的分子细胞生 物学机理
重组卵细胞最初分裂时虽复制了DNA,但基 因的转录并未开始； 重组移核细胞丢失了源于供体细胞的调节蛋 白； ，供体细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中 的蛋白因子替换了，因此核DNA表达程序被重 新编排，细胞开始表达自己的基因。