PCR-SSP ABO基因分型实验操作规程

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PCR-SSCP实验操作详细步骤

PCR-SSCP 实验步骤一．样品制备1．PCR 扩增并检测。

根据不同的引物挑选适合的退火温度进行 PCR 扩增。

扩增产物用 2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量 3-5ul。

PCR 产物为 10ng/nl 左右为最佳。

2．PCR 产物与变性 buffer 混合。

在干净的 PCR 管底部加入 5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入 PCR 扩增产物。

按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加 3ul 的 PCR 产物，缓冲液加到 8ul 变性效果更好。

3．PCR 产物变性。

加好的样品进行离心，使样品集中在管底。

PCR 仪上 95℃变性 10 分钟，立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置 5min，以免变性的产物复性。

注：3 和 4 步可以在制 SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。

二．制胶1．装板。

在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用 ddH2O 冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待 2-3min 酒精挥发。

将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。

（可用无水乙醇测试是否漏胶）。

2．配胶。

甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：8%6%30%PAGE 2.7ml1ml10×TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）8%6%4.05ml 2 ml30%PAGE（4℃）10×TBE 1.5ml1m50%甘油 1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10ml3．灌胶。

pcr 操作流程

pcr 操作流程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于复制DNA片段的技术，它可以在短时间内扩增出数百万份特定DNA序列。

PCR技术在分子生物学、医学诊断、法医学等领域有着广泛的应用。

下面将介绍PCR的操作流程。

首先，准备PCR反应体系。

PCR反应需要的基本组成包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、DNA聚合酶、缓冲液和水。

引物是PCR反应的关键，它们是用来识别目标DNA序列并引导DNA聚合酶合成新链的短链DNA片段。

其次，进行PCR反应。

PCR反应通常分为三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，将PCR管中的混合物加热至95°C，使DNA双链解旋成两条单链。

在退火步骤中，将反应温度降至50-60°C，引物与目标DNA序列结合。

在延伸步骤中，将反应温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。

最后，进行PCR产物的分析。

PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。

凝胶电泳可以用来检测PCR产物的大小和纯度，实时荧光定量PCR可以用来定量PCR产物的数量。

在PCR反应中，需要注意一些常见的问题，如引物的设计、反应条件的优化、污染的防止等。

此外，PCR反应的结果也需要谨慎解读，避免误判。

总的来说，PCR技术是一种简单、快速、高效的DNA复制技术，广泛应用于科研和临床实验中。

熟练掌握PCR的操作流程和技巧，可以提高实验效率和准确性，为科研工作提供有力支持。

PCR-SSCP实验原理和操作步骤

PCR-SSCP实验原理和操作步骤(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)【实验目的】1．了解PCR-SSCP技术的原理。

2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。

【实验原理】PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。

它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。

PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。

其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。

因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。

目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。

单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。

因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

【实验用品】1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。

2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。

PCR-SSP方法用于ABO疑难血型检定

&’( 血型 - 血型检定文献标识码： #
文章编号：（4++,） 0++)$*)23 +,$+05.$+4 匀，放入 ,.P 水浴 0*=>?，取出加入蛋白质沉淀液并强烈震荡将上清移入另一个离心管并加入 0*L， 04 +++F - =>? 离心 0=>?，异丙醇，摇匀，弃上清， ,++ C 04 +++F - =>? 离心 0=>?， 89& 沉淀 # 用 JQ 缓冲液溶解， )P 保存待用。 $%) 扩增引物 &’( 血型基因 .对分型引物由美国 GTJ 公司设计合成、鉴定，用于 !"# 特异性扩增 !0、 !4、 "、 #0、 #4 基因（表 4 ）。内对照为人类生长激素（ :G:）基因序列引物：和 *U$G""JJ"""&&""&JJ"""JJ&$,U *U$J"&" GG&J JJ"J$ GJJGJGJJJ$,U， !"# 扩增产物片段长度为 )42KV。表&
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Super007-004.1 人类ABO血型A亚型基因分型检测试剂盒(PCR-SSP法)说明书

Tianjin Super Biotechnology Developing Co., Ltd人类ABO血型－A亚型基因分型检测试剂盒（PCR-SSP）包装规格：4/8/20人份产品代码：SUPER007-004-004SUPER007-004-008SUPER007-004-020★仅供研究，不用于临床诊断【产品名称】通用名称：人类ABO血型－A亚型基因分型检测试剂盒(PCR-SSP)英文名称：Human ABO Bloodtype－A subgroup genotyping kit【包装规格】包装规格：4 / 8 /20人份【预期用途和简介】已知ABO血型系统中A亚型包括，A1、A2A3、Aw、Ax、Am & Ael等。

A1亚型具有A1抗原、A抗原和H抗原，血清中含有抗B抗体；A2亚型则只有A抗原和H抗原，其血清中除含抗B抗体，还有少量抗A1抗体，在血清学实验中约25%能与A1红细胞发生的凝集反应。

本试剂盒检样可为外周血、羊水、骨髓、组织、皮肤、血痕等提取的DNA，具有分型准确、快速、DNA需求少、针对中国人群设计优于同类进口试剂盒等优点。

可用于个体识别，疑难配血，新生儿溶血病的产前和产后诊断、骨髓干细胞移植（血型转换期间）和器官移植，以及肿瘤或病毒感染后血型一过性改变的基因识别。

【试剂盒原理】根据Genebank公布的基因序列，通过针对A亚型基因不同碱基的替换或缺失设计特异性引物，设计该特异性碱基为正义链引物的3′末端，由于Taq酶缺乏3′-5′外切酶活性，与引物3′末端不相配的等位基因模板不能进行扩增，而与引物3′末端相配的等位基因顺利扩增；其中每孔已经包含有内参质控品为人类生长激素（HGH）的保守片段设计，内参扩增产物作为有效试验在电泳中显现。

可识别A亚型基因包括：A2、A3、Aw、Ax、AM、Ael & O。

【主要组成成分】1.试剂盒组成B.浓缩dNTPs-Buffer：包括200mM dNTPs 、3.5mM Mg2+、500 mM KCl，100 mM Tris-HCl，1% Triton X-100等，使用前用无菌去离子水稀释。

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

（89:-;;8）
黄疸是新生儿尤其是早产儿的常见症状，可以由各种原因引起，其中包括母儿血型不合导致的溶血。在临床工作中准确的鉴定新生儿血型以确定黄疸原因及恰当治疗十分必要。为此，我们用PCR-SSP法检测胎儿、新生儿 ABO 血型，对 ABO 血型检测方法进行了研究。
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404
西安交通大学学报（医学版）
第24卷
P12、P13是一对对照引物。由以上引物组成8个独立的反应体系：
1.P1+P3+P12+P13 2.P2+P3+P12+P13
3.P4+P6+P12+P13 4.P5+P6+P12+P13
5.P7+P6+P12+P13 6.P8+P6+P12+P13
-
A2A2
A
-
+
-
+
A1A1

pcr-sscp检测

实验七PCR-SSCP检测一、实验目的1．了解PCR-SSCP技术的原理。

2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。

二、实验原理SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)：单链构象多态性检测，是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。

它是一种简单、快速、经济的基于DNA构象差别来检测点突变的方法。

相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。

单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。

空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。

因此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。

该方法简便、快速、灵敏，但它也有不足之处。

例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。

三、实验用品1．聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，电泳仪，电泳槽。

2．8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29：1）、1*TBE、5*TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。

四、实验步骤1．PCR产物经琼脂糖电泳确认特异性好的PCR产物才能用于PCR-SSCP检测，无条带或出现非特异性条带的产物都不能用于PCR-SSCP检测。

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1 装板在所要进行实验的每一副玻璃板（事先洗静、风干）的两边及底部装上垫片，尽量使底边及侧边紧密接触，夹子固定好，确保接头处都封上，以免漏胶。

pcr实验基本流程

pcr实验基本流程
一。

PCR 实验准备工作那可是相当重要。

1.1 首先得把实验材料备齐喽，像引物、模板 DNA、dNTPs、Taq 聚合酶，还有各种缓冲液，缺了啥都不行，这叫“兵马未动，粮草先行”。

1.2 仪器设备也得准备妥当，PCR 仪得性能良好，离心机、移液器都得调试好，不然关键时刻掉链子，那可就麻烦大了。

二。

实验操作得一丝不苟。

2.1 先把反应体系配好，各种成分的量都得严格按照要求来，多了少了都可能影响结果，这就好比做饭，盐多了太咸，盐少了没味。

2.2 加样的时候得小心谨慎，千万别把样品弄混了，一旦出错，那就是“一失足成千古恨”。

2.3 把样品放进 PCR 仪，设置好反应程序，温度、时间都得精准，这就像开车掌握好油门和刹车，才能稳稳当当到达目的地。

三。

实验结束后的工作也不能马虎。

3.1 反应结束后，要对产物进行检测，琼脂糖凝胶电泳就是常用的方法，通过电泳图谱能看出实验结果好不好。

3.2 对实验结果进行分析和判断，看看是不是达到了预期的目标，如果不理想，就得找找原因，是操作失误还是实验设计有问题，“吃一堑，长一智”，下次可不能再犯同样的错误。

PCR 实验就像一场精心策划的战斗，每个环节都要考虑周全，操作精准，才能取得胜利，得到满意的结果。

PCR-SSCP实验步骤(仅供参考)

PCR-SSCP实验步骤（仅供参考）1、PCR（例：15uL体系，n个样）A、取n个PCR管，做好标号。

B、配混合液（1.5mL离心管中）mix （n+1）×7.5uLDNApol （n+1）×0.15 uL引物（上）（n+1）×0.2 uL引物（下）（n+1）×0.2 uL无菌水（n+1）×5.95 uLC、分装：14uL/PCR管。

（注意枪头最好插到PCR管底部，打出混合液，待枪头离开PCR管再松手）D、加模板：1uL。

（注意加模板前一定要将模板DNA轻微振荡混匀，且枪头最好插到PCR管液面下打出模板，打出后待枪头离开液面后再松手）E、瞬时离心。

（长按short spin键，待转速升到10000r/min即可松手，使其自然停转）F、PCR仪中扩增。

G、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

（注意结果好时才可做SSCP）２、SSCP(1)制胶与电泳（此步要尽量统筹好时间）A、洗玻板、梳子，烘干，润湿胶条。

(注意玻板尽量洗净，千万不能留指纹或其他污物。

此步最好提前做好)B、润湿毛玻璃（注意蒸馏水不可弄的太多），放胶条，放另一块玻板，封好胶条（尤其毛玻璃最下端），用夹子在两侧夹好玻板（最好往两侧最下端夹，且夹在毛玻璃位置）。

C、制胶(例：20mL、8％。

注意不同片段长度所用胶浓度不同）30％Acr/Bis 5.334mL10×TBE 4mL10％Ap 250uLTEMED 25uL蒸馏水11.066mL添加顺序：蒸馏水→30% Acr/Bis→10×TBE→10% Ap→TEMEDD、混匀PAGE，迅速倒胶，注意不要产生气泡（最好从胶槽中间倒），插入梳子，切勿在齿下留有气泡。

E、室温聚合约10分钟后，取出梳子（用力要均衡），迅速用蒸馏水冲洗点样孔，用注射器吸净孔内的水，放置胶板，倒入电泳缓冲液(1×TBE)。

（注意胶板下端千万不要留有气泡，要仔细检查）F、电泳槽置冰水混合物中250V预电泳10分钟。

pcr实验流程和注意事项

PCR实验流程如下：
试剂准备阶段：在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。

所有的PCR体系都应该在-20℃保存，除了ddH2O之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。

配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。

体系配制完成之后应马上进行PCR反应。

样本制备阶段：样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。

严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。

所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。

戴手套并勤于更换，要有无核酸观念。

在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。

PCR实验注意事项：
引物长度通常在18-22个碱基之间。

解链温度Tm值通常要在52-58度之间。

GC含量也是一个重要的因素。

以上信息仅供参考，具体步骤和注意事项可能会因实际情况而有所不同，建议咨询专业人士获取更准确的信息。

ABO疑难血型鉴定标准操作规程

ABO疑难血型鉴定标准操作规程1.目的为规范ABO疑难血型鉴定操作，保证临床输血安全有效，依据《输血实验室管理程序》4.1.7（2）条款制定本规程。

2.适用范围适用于输血科（血库）对ABO血型鉴定正反定型不相符，常规方法不能确定ABO血型的进一步确认试验。

3.职责输血科（血库）技术人员负责ABO疑难血型鉴定。

4.原理、抗-AB、抗-H试ABO血型鉴定正反定型不相符时，通过采用单克隆抗-A、抗-B、抗-A1剂与受检者红细胞反应检测ABH抗原、A、B、O型试剂红细胞及自身红细胞与受检者血清（血浆）反应检测血型抗体，红细胞吸收放散试验检测弱A、弱B抗原，凝集抑制试验检测唾液ABH血型物质，血清（血浆）吸收试验排除ABO血型以外的抗体对鉴定的影响，从而获得确定受检者ABO血型的依据，确定ABO血型。

5.所需设备和试剂5.1设备普通离心机，血型血清学专用离心机，电热恒温水浴箱或电炉，普通显微镜，水浴振荡仪。

5.2试剂红细胞不规则抗体筛选阴性的人源抗-A、抗-B血清，单克隆抗-A、抗-B、抗-H试剂，抗球蛋白试剂，A、B、O型试剂红细胞。

6.检测环境条件室温应控制在18-27℃，湿度应保持30%-70%。

7.步骤与方法7.1收集受检者临床资料当执行《血型鉴定标准操作规程》鉴定ABO血型出现正反定型不相符，并以排除试剂及操作因素时，应调查受检者的疾病史、输血史、药物治疗情况、组织或器官移植史、孕产史及以前的血型记录，分析可能影响ABO血型鉴定的临床资料。

7.2根据受检者正反定型的反应结果及临床资料，初步分析引起正反定型不符的可能原因。

7.2.1当正定型红细胞与抗-A和（或）抗-B无凝集，而反定型未检出预期的凝集反应时，应首先确认是否红细胞表达弱A和（或）弱B，与抗-A和（或）抗-B不凝集。

经吸收放散等实验确认红细胞不表达A和（或）B抗原后，可考虑是否为低免疫球蛋白血症、免疫抑制等致血型抗体异常。

7.2.2当反定型检出了与正定型不相符的凝集时（如反定型与O型试剂红细胞凝集）应考虑血清（血浆）中是否存在红细胞不规则抗体。

pcr的实验流程及注意事项

pcr的实验流程及注意事项嘿，小伙伴们！今天咱们来唠唠PCR这个超酷的实验呀！PCR 呢，就是聚合酶链式反应，在分子生物学里那可是相当重要的一个实验呢！**一、PCR的实验流程**1. 首先是样本准备呀！哎呀呀，这个步骤可不能马虎呢。

咱们得先获取到含有目标DNA的样本，这个样本来源可就多啦，可能是血液、组织或者细胞之类的哇。

在提取样本中的DNA时，一定要小心谨慎，要确保DNA的纯度和完整性呢！如果DNA提取得不好，后面的实验可就麻烦大啦！2. 接下来就是引物设计啦！哇，这可是个技术活呢。

引物就像是一把钥匙，要能够精准地结合到咱们想要扩增的DNA片段上才行呀。

引物的长度、GC含量这些参数都得好好考虑呢！一般来说，引物长度在18 - 25个碱基左右比较合适，GC含量在40% - 60%之间是比较理想的呢。

要是引物设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段，那可就白忙活一场啦！3. 然后就是反应体系的配制喽！这一步需要把各种试剂按照一定的比例混合在一起呢。

像模板DNA、引物、dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、Taq酶还有缓冲液这些都是必不可少的呀。

哎呀呀，在加试剂的时候一定要准确呢，哪怕是一点点的误差都可能影响实验结果哇！比如说Taq酶加多了或者加少了，反应的速度和效率就会发生变化呢。

4. 再然后就是把配制好的反应体系放到PCR仪里面进行反应啦！这个PCR仪就像是一个神奇的小盒子，它会按照咱们设定好的程序来进行加热、冷却的循环呢。

一般来说，PCR反应会经过变性、退火和延伸这三个步骤的循环。

变性的时候温度比较高，大概在90 - 95℃左右，这个时候DNA双链会解开变成单链呢；退火的时候温度会降低，这个温度要根据引物的Tm值解链温度）来设定，一般在50 - 65℃之间，这时候引物就会和模板DNA结合上；延伸的时候温度大概在72℃左右，Taq酶会以引物为起点，把dNTP一个一个地连接到新合成的DNA链上呢。

循环的次数也很关键，通常是25 - 35次左右，循环次数太多或者太少都可能导致实验结果不理想呢！**二、PCR的注意事项**1. 哇，实验室的环境清洁可是相当重要的呢！如果实验室里有太多的杂质或者其他DNA的污染，很容易就混到咱们的实验样本里面去啦。

ABO血型分型操作规程sop

ABO血型分型操作规程sop
1．项目名称：ABO血型分型
2．方法：玻片法
3．试剂：抗A、抗B血型定型试剂（单克隆抗体）
上海市血液中心生产
含抗A、抗B血型定型试剂各10ml
成分：分泌抗人A型和抗人B型血型抗原单抗的杂交瘤细胞培养上清液。

4．原理：A型红细胞膜上含有A抗原，B型红细胞膜上含有B抗原。

AB型红细胞膜上含有A、B两种抗原。

O型红细胞膜上不含有抗原。

抗A、抗B分型试剂与受检者的红细胞混合时，可发生凝集，结果判定见下表：
5．操作步骤：将抗A分型试剂、抗B分型试剂各一滴，分别滴于玻璃片A、B两处。

分别取等体积待检血样于抗A分型市集和抗B分型试剂处，用不同的竹签将市集与血样混匀，同时不停的摇动玻璃片并观察血球凝集的出现
6．注意事项：1。

调匀后就不要用竹签搅动，以免影响大凝块的形成。

2．如发现检定结果与交叉合血结果不符，应进行反定型。

3.对含有较多自身凝集素的受检者，需用37度生理盐水洗涤受检者红细胞2—3次，然后鉴定。

7．标本要求病人准备：新鲜静脉血或末梢血.采血应顺利，不应有溶血和凝块。

对病人无特殊要求，特殊病人由临床医生告知注意事项8. 参考文献：
1)全国临床检验操作规程（第3版）
2)厂商说明书
9. 编写者：
制定日期：
修改日期：
科主任对规程认可：。

ABO血型基因型检测实验步骤

ABO血型基因型检测实验【实验材料】pBR322/Msp I Marker；ABO基因复合PCR扩增产物。

【实验准备】1. 器材：电泳仪、垂直板电泳槽系统、脱色摇床、涡旋混合仪等；2. 试剂：生工PCR试剂盒、引物由生工合成、NEB内切酶AluI和KpnI-HF、DNA加样缓冲液(6×)、10×TBE电泳缓冲液(贮存液)、40%丙烯酰胺预混液(Acr-Bis 液，19∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、10%(M/V)过硫酸铵(APS)、GeneGreen核酸染料等；2.1 染色液：用0.1g AgNO3定溶于100mL超纯水中，现配现用；2.2 显色液：1.2g NaOH，400μL 37%甲醛溶液定容于100mL预冷的超纯水中，现配现用；2.3 固定液：10%冰乙酸，10mL冰乙酸定容于100mL超纯水中。

【实验步骤】一、ABO血型基因多重PCR扩增技术多重PCR反应混合体系配制(表1、表2)：在冰上放置0.2mL PCR管，根据总体积(50μL)加入无菌ddH2O，将PCR试剂解冻后置于冰上操作，可按体积由大到小顺序依次加入相关成分，配制反应混合体系；表1 多重PCR引物引物序列碱基数浓度预计产物1：5'-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3' 20bp 5μM200bp (A和B等位基因)2：5'-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3' 20bp 5μM199bp (O等位基因)3：5'-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3' 21bp 5μM159bp (A、B和O等位基因) 4：5'-CACCGACCCCCCGAAGAA-3' 18bp 5μM表2 多重PCR混合体系(50μL)组别DNA模板10×buffer MgCl2dNTPs 引物1 引物2 引物3引物4Taq酶ddH2O 实验组5μL5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL26.7μL 对照组—5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL31.7μL 终浓度20~500ng 1× 1.5mM 0.2mM 0.2μM0.2μM0.1μM0.1μM 1.5U —将配制好的混合液轻轻混匀并轻微离心，在PCR扩增仪上按下表编入程序(表3)：表3 PCR程序设定参数预变性变性退火延伸延伸保存温度95℃95℃60℃72℃72℃4℃时间2min 30s 30s 30s 3min 备用循环数 1 30 1 ∞编完反应程序后，置PCR管于PCR扩增仪反应孔中，开动机器。

PCR-SSP分析实验原理和步骤

PCR-SSP分析实验原理和步骤2010-04-03 11:17:37 来源：易生物实验浏览次数：524 网友评论0 条根据决定某等位基因的碱基性质，设计3´端第一个碱基分别与各等位基因的特异性碱基相匹配的序列特异性引物，在PCR 反应过程中，只有引物3´端第一个碱基与决定特定等位基因的碱基互补时才能实现DNA 片段的完全复制，根据PCR 产物的有无进行等位基因的分型。

关键词：PCR-SSP分析PCR-SSPPCR序列特异性引物sequencespecificprimerSSPPCR 序列特异性引物（sequence specific primer,SSP）分析法是使用能够特异识别特定等位基因的引物通过PCR 扩增检测序列多态性的方法，也称作等位基因特异性引物PCR 法。

本实验是应用PCR-SSP 法检测MN 基因型。

[实验原理]根据决定某等位基因的碱基性质，设计3´端第一个碱基分别与各等位基因的特异性碱基相匹配的序列特异性引物，在PCR 反应过程中，只有引物3´端第一个碱基与决定特定等位基因的碱基互补时才能实现DNA 片段的完全复制，根据PCR 产物的有无进行等位基因的分型。

[实验器材]PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽。

易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂库：/yp/product-list-43.html[实验试剂]引物1：5´-GCATCAAGTACCACTGGT-3´；引物2：5´-GCATTAAGTACCACTGAG-3´；共通引物：5´-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3´。

模板DNA、Taq 聚合酶、丙烯酰胺、电极缓冲液、上样缓冲液等[实验方法]1.PCR 扩增PCR 反应体系为20μl（2 个体系，分别为引物1 和引物2），含模板2μl(约50ng)，引物各1.5μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer 缓冲液2μl，Taq 酶1.0U，加双蒸水至20.0μl；PCR 反应条件为94℃4min，94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30 个循环。

ABO疑难血型鉴定中应用PCR—SSP法的探讨

ABO疑难血型鉴定中应用PCR—SSP法的探讨目的对ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的临床价值进行探讨。

方法选取2015年1月～2016年12月我院收治的225例ABO疑难血型受试者，分别给予PCR-SSP法和血清学定型方法进行检测，对比相关数据差异。

结果PCR-SSP 法与血清学定型方法的检测结果比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中临床应用价值高，值得临床输血工作者关注。

[Abstract]Objective To explore the clinical value of PCR-SSP in the identification of suspicious ABO blood group.Methods 225 cases of suspicious ABO blood type subjects admitted by our hospital from January 2015 to December 2016 were selected and respectively tested by the PCR-SSP and serological typing methods.The relevant data differences were compared.Results The results of PCR-SSP and serological typing methods were compared and the differences were statistically significant （P＜0.05）.Conclusion The PCR-SSP method has high clinical value in the identification of suspicious ABO blood group and it is worth the attention of clinical transfusion workers.[Key words]ABO blood group；Serological typing；PCR-SSP早在1900年ABO血型系統对于临床输血治疗过程中所具有的重要指导意义就已经被发现，并得到广泛性的认可。

PCR-SSP方法用于ABO疑难血型检定

PCR-SSP方法用于ABO疑难血型检定
郭如华;邢培清;张伯伟
【期刊名称】《中国输血杂志》
【年(卷),期】2003(16)3
【摘要】ABO血型的准确定型是输血安全的重要保证.血清学技术检测ABO血型简单快速,但有局限性:受生理、病理等诸多因素的影响可导致正反定型不符.ABO 血型基因的检测可作为血清学检测的补充.笔者采用PCR-SSP方法对ABO正反定型不符的标本作基因分型,报告如下.
【总页数】2页(P187-188)
【关键词】PCR-SSP;A、B、O基因;ABO血型/血型检定
【作者】郭如华;邢培清;张伯伟
【作者单位】河南省红十字血液中心
【正文语种】中文
【中图分类】R457.11;Q503
【相关文献】
1.PCR-SSP与血清学技术用于ABO血型分型的比较 [J], 毛征宇;万本愿;王文丁;陈会;徐红萍
2.PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中的应用 [J], 肖莉;后平钦;李国良
3.PCR-SSP基因分型技术在ABO疑难血型定型中的应用 [J], 陈志忠;廖扬勋;陈尚良;余文潮;梁剑锋;车京霞
4.ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的探讨 [J], 钟胜英
5.基因分型和ABO疑难血型三步分析法鉴定ABO疑难血型1例 [J], 柯浩珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PCR操作流程【范本模板】

PCR操作流程一、实验目的1。

掌握聚合酶链式反应的原理.2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖)建立的.这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍,这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义,极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值.PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术,其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段.细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程.参与复制的有多种因素。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应,基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单.PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链,以便它与引物结合，为下轮反应做准备;②模板DNA与引物的退火（复性）:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性—-退火—-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶 0.5μL。