15-刘义庆-PCR试剂盒选用和质检_15

临床PCR试剂、耗材的选用和质检
刘义庆
山东省立医院临床医学检验部
Kary Mullis PCR 技术最早由美国
Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于
1985年发现并研制成功。

Kary Mullis 因发明了
“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。

原理
PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。

经过若干循环后使目的DNA得以迅速扩增。

PCR技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。

目前，临床PCR检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒。

●PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而
且是至关重要的
●试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制
诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的质量有决定性的影响
●如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？
●如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量?
PCR或RT-PCR试剂盒的组成●核酸提取试剂
●核酸扩增或逆转录－核酸扩增试剂
●产物检测试剂（有些使用全自动分析仪的PCR 方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门的产物检测试剂）
影响PCR试剂盒质量的因
素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计
外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存
影响PCR试剂盒质量的因素：
核酸扩增所需的原材料
●寡核苷酸引物
●扩增缓冲液
●dNTP
●Taq酶以及反转录酶等
寡核苷酸引物和探针
●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响：纯度的高低可根据260/280吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化。

另一种方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上的带或迁移位置错误，则需重新纯化。

●引物和探针的结合特异性：应减少假阳性或假阴性的出现
扩增缓冲液和dNTP
●缓冲液包括：Tris-HCL(pH8.3~8.8)，KCl或NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、Tween20或DTT
●Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增
●四种dNTP的终浓度应相等
Taq酶以及反转录酶
●酶的浓度：酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低。

●酶的活性：每100μl反应液中含1～2.5U（比活性为20U/pmol）Taq DNA聚合酶为佳。

核酸扩增方法
PCR
RT－PCR
转录依赖的扩增（TMA）
连接酶链反应（LCR）
链替代扩增（SDA）等
影响PCR试剂盒质量的因素：
核酸提取
核酸提取的有效性
核酸提取的简便性
核酸提取方法
●经典方法：酚－氯仿抽提法，提取效率高、纯度好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会
●简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。

核酸提取的效率及纯度的检测
使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂血血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。

影响PCR试剂盒质量的因素：
产物检测
杂交固相
特异探针及其标记物
产物检测
●杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，其质量高低直接影响产物的测定
●标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）
影响PCR试剂盒质量的因素
内在因素: 原材料、核酸提取方法、方法学设计
外在因素：试剂盒的运输和贮存外在因素：试剂盒的运输和贮存
试剂盒的运输和贮存
●贮存：核酸扩增部分试剂存储于－20℃以下，产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。

●有效期:在适当的贮存温度下，PCR试剂盒的有效期一般为6个月。

●试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中的贮存，任一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。

临床PCR试剂盒的分类
●临床PCR试剂盒按其测定目的可分为定性和定量测定两大类
●前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断●后者则是用于已知患者治疗的动态观察
临床PCR试剂盒的分类
目前国内用于定性测定的PCR试剂盒的测定模式主要有PCR－ELISA和PCR－膜上杂交（杂交流）和分子信标荧光检测等；
用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有TaqMan和Amplisensor荧光定量以及PCR－ElISA定量等
临床PCR试剂盒的选用原则
●参考试剂生产厂家的信息广告
●参考同行对有关试剂盒的使用效果
●参考有关机构的综合评价
●根据使用目的的选择
●根据所在实验室的技术特点选择
●根据所在地区患者的承受能力选择
PCR试剂盒的质检
外包装：厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等。

内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。

PCR试剂盒的质检(定性测定)
性能质检
采用血清（样本）盘（Panel）质检：PCR试剂血清（样本）盘由一定数量的原血清阴、阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所组成。

样本总数可定在20份左右。

原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增的有效性。

系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限。

质检时，用待检PCR试剂盒测定血清盘中的各份样本，以血清盘的结果为标准，计算被检PCR试剂盒的灵敏度、特异性和符合率。

试剂盒评价四格表
血清盘结果（+）血清盘结果
（-）
合计
被检试剂盒结果（+ ）a b a+b 被检试剂盒结果（-）c d c+d
合计a+c b+d a+b+c+d 表中a为真阳性，b为假阳性，各项指标的计算公式如下：
特异性（%）=d/b+d×100%
灵敏度（%）=a/a+c×100％
符合率（%）=a+d/a+b+c+d×100％
理想情况下，试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应为100%。

此外，也可采用弱阳性（低拷贝数）质控物进行质检。

对不同试剂生产厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同一弱阳性定值质控物检测，可比较出不同厂家或不同批号试剂盒的测定下限的差异。

在每次临床检测中，同时带上弱阳性质控物与临床标本一起检测，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要的参考价值。

PCR试剂盒的质检(定量测定
)
样本：已知浓度的高、中、低三种浓度度标准物/质控物/临床样本（覆盖检测范围）。

质检内容：测定的重复性（批内、中间精密度）
测定范围/可报告范围
线性检测系统性能验证
抗干扰能力
PCR耗材质检
带滤芯吸头的质检
密封性：
制备一个含1%--2%甘油及色素的水溶液（甲基橙、红墨水、蓝墨水），如最大体积为100ul，则将加样器吸取体积调到110-
120ul后，套上吸头吸取上述有色液体。

如吸头质量好，有色液体不应出现在滤芯之上，否则说明滤芯不严。

离心管的质检
PCR抑制物：
从新购的离心管中，抽取6-10支，采用已知的高、中、低3 个浓度的HBV DNA样本，使用抽取的离心管按程序进行检测，每一浓度双管重复，同时使用已知无PCR抑制物的离心管作为对照，如结果与预期或对照管明显偏低，（如1-2个数量级），则证明有抑制物存在。

离心管的质检
密封性：
从新购的离心管中，抽取6-10支，加入一定量的液体，（如500ul的水），在100℃条件下10分钟，观察是否有暴管现象。

抽取6-10支，加入一定量的液体，高速离心，观察离心管是否的破管。