WB课件
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Ansys 14.0 Workbench 课件3-WB-Intro_Introduction
Release 14.0
附录
内容 • 工具箱 • 连接类型 • 建立 Project Schematic : 例子 • 菜单
• 全局设置
• 参数化 &优化设计 • Workbench文件结构
28
© 2011 ANSYS, Inc.
March 10, 2014
Release 14.0
工具箱
- 预定义模块 - 个性化应用来建立或使用分析系统（AS） - 耦合分析用预定义/好的模版或者用户自定义分析系统 - 参数化管理和优化工具
全局设置(2)
• Appearance :
- 管理背景，颜色 - 管理显示选项
• Graphics Interaction :
- 管理鼠标按键的操作 - 管理键盘按键的操作
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© 2011 ANSYS, Inc.
March 10, 2014
Release 14.0
导入参数 : 例子
CATIA V5
信息窗口 进度窗口
Release 14.0
项目管理区
• 拖放Analysis 、 Component或 Custom系统至 schematic ，就可以创建一个 Project。 • 拖放的位置指定了系统之间的“连接类型”。 • “连接类型”由系统之间的 “接头类型”表示。
共享Component
创建一个单独的系统
– 应用框架 • 发展一个新的，先进的用户界面，应用程序，用户界面（UI）工具盒。 – 常见工具及服务 • 本地数据管理 • 参数化管理和设计要点，单位制，表达式和记录，脚本编写和执行 批处理
3
© 2011 ANSYS, Inc.
March 10, 2014
韩玉军-国际商务-课件
《国际商务》
内容简介
随着经济全球化的发展，世界正在快速变化着，当企业 走向世界成为国际企业时，它将面临一系列新的挑战，国际管 理人员为应对挑战，除需要掌握基本的经济学与管理学的原理 外，还需掌握和实行各种战略和政策才能获得成功。本教材 《国际商务》就是为适应这一形势和需要而推出的一本内容非 常丰富、新颖、资料翔实、结构清新、规范完整的教材。
第一，全球化是跨国公司的全球化。 第二，全球化的实质是美国化。
（2）认为经济全球化是资本主义化、美国化，因此本质上就是 经济殖民主义，是帝国主义发展的新阶段，必须坚决批判与反 对，这是所谓“新马克思主义”观点或“左”派观点。
。
（3）怀疑派观点。认为历史并没有显现所谓全球化的事实，充 其量不过是出现了高水平的国际化，也就是国家之间经济互动 而已，经济全球化是某些理论家的神话。
本教材以环境-理论-战略与组织结构-运营作为分析逻辑线 索与框架，围绕国际企业运行理论基础、商务环境和企业资源 能力，探讨了国际企业的战略竞争与组织结构，特别是从动态 竞争的角度分析了国际企业如何获取可持续发展的竞争优势。
,
具体内容除了导论外，可以分为4部分：第1部分：国际商务环境。 从宏观或从国家层面介绍国际企业经营面临的政治、经济、法 律、社会等国家因素的差异性，同时介绍文化差异对国际企业 经营的影响。第2部分：国际商务理论基础。从贸易、投资、 金融以及国际生产等方面，介绍国际商务的基本理论。第3部 分：国际企业的战略与组织。对国际企业的竞争战略以及组织 结构，包括战略联盟与并购等进行深入介绍。第4部分：国际 企业的运营。从国际市场营销、供应链管理、人力资源管理、 财务管理等方面分析和研究国际企业在全球运作中的管理问题。
（4）认为全球化是21世纪推动社会经济、政治快速变革的中心 力量，这些变革正在重新塑造着现在世界，即著名的“变革 论”。但未来如何变革，尚看影响这一变革过程的各种因素以 及相互博弈的结果。
内容简介
随着经济全球化的发展，世界正在快速变化着，当企业 走向世界成为国际企业时，它将面临一系列新的挑战，国际管 理人员为应对挑战，除需要掌握基本的经济学与管理学的原理 外，还需掌握和实行各种战略和政策才能获得成功。本教材 《国际商务》就是为适应这一形势和需要而推出的一本内容非 常丰富、新颖、资料翔实、结构清新、规范完整的教材。
第一，全球化是跨国公司的全球化。 第二，全球化的实质是美国化。
（2）认为经济全球化是资本主义化、美国化，因此本质上就是 经济殖民主义，是帝国主义发展的新阶段，必须坚决批判与反 对，这是所谓“新马克思主义”观点或“左”派观点。
。
（3）怀疑派观点。认为历史并没有显现所谓全球化的事实，充 其量不过是出现了高水平的国际化，也就是国家之间经济互动 而已，经济全球化是某些理论家的神话。
本教材以环境-理论-战略与组织结构-运营作为分析逻辑线 索与框架，围绕国际企业运行理论基础、商务环境和企业资源 能力，探讨了国际企业的战略竞争与组织结构，特别是从动态 竞争的角度分析了国际企业如何获取可持续发展的竞争优势。
,
具体内容除了导论外，可以分为4部分：第1部分：国际商务环境。 从宏观或从国家层面介绍国际企业经营面临的政治、经济、法 律、社会等国家因素的差异性，同时介绍文化差异对国际企业 经营的影响。第2部分：国际商务理论基础。从贸易、投资、 金融以及国际生产等方面，介绍国际商务的基本理论。第3部 分：国际企业的战略与组织。对国际企业的竞争战略以及组织 结构，包括战略联盟与并购等进行深入介绍。第4部分：国际 企业的运营。从国际市场营销、供应链管理、人力资源管理、 财务管理等方面分析和研究国际企业在全球运作中的管理问题。
（4）认为全球化是21世纪推动社会经济、政治快速变革的中心 力量，这些变革正在重新塑造着现在世界，即著名的“变革 论”。但未来如何变革，尚看影响这一变革过程的各种因素以 及相互博弈的结果。
《国际金融学》PPT课件全
现代国际金融学时期
以布雷顿森林体系为研究背景，分析 国际货币制度演变及国际金融市场发 展。
国际金融学的研究方法
实证分析方法
运用统计数据和计量经济学工具，对国 际金融现象进行定量分析和检验。
案例分析方法
通过对典型国家或地区的国际金融实 践进行案例分析，提炼经验和教训。
规范分析方法
基于经济学原理和国际金融理论，对 国际金融问题进行定性分析和逻辑推 理。
国际资本流出可分散母国投资风险，获取更高收益；但也可能导致 母国产业空心化、失业率上升等问题。
对全球经济的影响
国际资本流动推动了全球范围内的资源配置优化和经济增长；但同 时也加剧了全球经济波动和风险传递。
国际资本流动的管理与政策
01
管理措施
02
实行外汇管制：通过对外汇的买卖、兑换和转移进行限制 ，控制国际资本流动。
04
CATALOGUE
国际金融市场
国际金融市场概述
1 2
定义
国际金融市场是指由国际性的资金借贷、结算、 汇兑以及有价证券、黄金和外汇的买卖活动所组 成的市场。
功能
国际金融市场的主要功能包括资金融通、外汇买 卖、风险管理、国际结算以及信息传递等。
3
分类
根据交易性质的不同，国际金融市场可分为货币 市场、资本市场、外汇市场、黄金市场以及衍生 金融工具市场等。
牙买加体系
1976年牙买加协议确立了以浮动汇率制为主导的国际货币体系，各国 可自由选择汇率制度，国际储备货币多元化。
布雷顿森林体系
建立背景
二战后，美国经济实力空前膨胀，黄金储备占全球70%以 上，为建立以美元为中心的国际货币体系奠定了基础。
主要内容
美元与黄金挂钩，其他国家货币与美元挂钩，实行可调节 的固定汇率制度；成立国际货币基金组织和世界银行两大 国际金融机构。
《项目计划》PPT课件
Max{tEF(-,i) } = 结束节点分别为i的各作业中的最早
结束时间的最大值
精选ppt
17
第四步计算公式为：
tLF(i,j) = Min{tLS(j,-) }
tLF(i,j) =tLS (i,j) + t(i,j)
上式中：tLS (i,j) = 开始与结束节点分别为i,j的作业的
最迟开始时间
成某项活动的预计成本。
精选ppt
29
时间一成本平衡法
（2）一项活动的工期可以被大大地缩短，从正 常时间减至应急（赶工）时间，这要靠投入更多 的资源来实现
（3）无论对一项活动投入多少额外的资源，也不 可能在比应急（赶工）时间短的时间内完成这项活 动。 （4）当需要将活动的预计工期从正常时间缩短至 应急（赶工）时间时，必须有足够的资源作保证。
精选ppt
3
（三）项目管理涉及的目标
质量
项目的质量管理必须贯穿于全方位全 过程和全体人员中
费用
包括实施该项目所有的直接费用和间 接费用的总和，注意控制项目的生命周 期费用，包括研制建设运行费用。
进度
通过控制各项活动的进度，确保整个 工期完成
精选ppt
4
（四）项目管理的要素
一般来说，一个项目有下列4个要素：
– 主要采用工作分解结构(Work Breakdown Structure,简称WBDS)，如图所示。
4. 确定工程的整体进度计划。 5. 作业进度计划调整。
精选ppt
9
产品开发项目的工作分解结构图
产品开发项目
产品创意 产品结构设计 产品制造
试制
精选ppt
10
项目控制
应做好以下基础工作： (1) 建立完善的工程项目的监控体系； (2) 建立健全项目控制文件体系； (3) 建立通畅的信息沟通网络。
WB实验简介PPT课件
一、收集蛋白样品(Protein sample preparation)
1.蛋白样品选择是否合适。(组织 细胞的表达特异性)
2.蛋白样品的处理时候合适。(刺 激效果是否达到)
3.蛋白样品的验证是否可靠。(包 括浓度，样品有没有降解等)
样品制备中用到的试剂
甘油：主要起沉降作用，让你在上样的时候不飘到孔外。
过三维网状结构的胶，由于蛋白分子的大小不同，质量不同，导致 它的迁移率不同，最终跑胶介绍会呈现分子量的一个梯状条带，分 子量大的跑的越慢。
浓缩胶：浓度比较低（4%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔 径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上
分离胶：浓度比较大（>10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电 压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可 能被拦住，所以能呈现分子量不同的梯度。
丽春红染色的实例
四、封闭(Blocking)
作用：用其他蛋白填满膜上无蛋白的部分空隙，以免孵抗体的时候一抗二 抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。
步骤：转膜完毕后，丽春红染色之后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的 TBST中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的丽春红染液。从转膜完毕起，以后 所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景 。加入封闭液（5%脱脂奶粉），在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭1-2小 时。
SDS：导致蛋白质变性，易于蛋白结合，形成易溶于水的复 合物。
β-mercaptoethanol：作为还原剂，打开二硫键，使蛋白质的 四级或三级结构被破坏，使蛋白成为寡氨基酸链。以与二硫 苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使 用
溴酚蓝：作为一种指示剂，成蓝色，只是我们样品跑胶的一 种程度。
WB报警及处理方法课件分解
KNS设备拉料夹子没有有效抓取PCB报警图片
处理方法： 此报警为KNS设备夹子抓取弹夹里PCB时，没有把PCB抓至感应器指定位置，产线操作员只需将该PCB推进弹夹，按自动运行即可， 此报警如一个小时内出现出现5次，需通知设备人员处理。
KNS设备出料口卡料报警图片
处理方法： 此报警位为KNS设备PCB出料口卡料导致，产线操作员需查看PCB有无变形，假如有变形，只需用手将其推进弹夹，点击数字键 3Recover继续运行即可，如出现操作失误，容易造成PCB破损或者金线倒塌的现象；假如PCB没有任何变形现象，退料夹子仍然 不能顺畅将料推进出料口弹夹，则需立即通知设备人员处理。
KNS设备瓷嘴到达设定的使用寿命的报警图片
处理方法： 此报警位为KNS设备提示瓷嘴到达设定的使用寿命，产线操作员需点击数字键4Abort，停止运行设备，按照更换瓷嘴 标准的SOP更换新的瓷嘴，然后清除原先的瓷嘴数据即可,如更换瓷嘴过程中出现任何异常，则需通知设备人员处理 。
KNS设备上料区域没有弹夹的报警图片
处理方法： 此报警为Die上PR对点报警，产线操作员只需根据设备屏幕上提示的Pad位的影像位置，对齐当前的两个Pad位即可，如对齐 错误，则会导致第一焊点金球打偏和翘起，虚焊的现象，此报警如一个小时内出现5次，需通知设备人员处理。
ASM Extreme 断线报警图片
处理方法： 此为ASM Extreme设备断线报警，产线操作员只需穿线切线，点击自动运行即可，此报警如一个小时内出现10次， 则立即通知设备人员处理。
KNS设备拉料夹子掉电报警图片
处理方法： 此报警位为KNS设备拉料夹子掉电报警，产线操作员需查看PCB有无变形，假如有变形，点击数字键4后，打开轨道取出变形的 PCB，点击继续运行即可；假如PCB没有任何变形现象,则立即通知设备人员处理。
《国际金融学》PPT课件
《国际金融学》PPT课件contents •国际金融学概述•国际货币体系与汇率制度•国际金融市场与金融机构•国际资本流动与金融危机•国际金融合作与协调•中国国际金融发展与实践目录01国际金融学概述国际金融学的定义与研究对象国际金融学的定义研究国际货币、国际资本流动和国际金融市场运行规律的科学。
研究对象包括国际货币制度、国际收支、外汇与汇率、国际储备、国际金融市场、国际资本流动、国际金融机构及国际金融监管等。
03当代国际金融学面临新的挑战，如金融科技、数字货币、气候变化对国际金融的影响等。
01早期国际金融学主要研究国际收支、外汇与汇率等问题。
02现代国际金融学随着经济全球化的发展，研究领域扩展到国际金融市场、国际资本流动、国际金融机构及国际金融监管等。
实证分析方法运用统计数据和计量经济学模型，对国际金融现象进行实证分析。
规范分析方法基于一定的价值判断，对国际金融政策和制度进行分析和评价。
案例分析方法通过对典型案例的深入剖析，揭示国际金融活动的内在规律和机理。
比较分析方法对不同国家和地区的国际金融制度、政策和实践进行比较分析，寻求共性和差异。
02国际货币体系与汇率制度以黄金作为国际储备货币或国际本位货币的国际货币制度。
金本位制布雷顿森林体系牙买加体系以美元为中心的国际货币体系，美元与黄金挂钩，其他货币与美元挂钩。
国际货币基金组织（IMF ）的协定第二次修正案在1978年4月1日正式生效，国际货币体系由此进入牙买加体系时代。
030201国际货币体系的演变汇率制度的类型与特点固定汇率制一国货币同另一国货币的兑换比率基本固定的汇率，即指一国政府为了维持经济的稳定，将本国货币与某种外国货币的比价固定在一定的范围之内，即使汇率的波动超过一定范围也采取干预措施。
浮动汇率制一国货币当局不规定本国货币与其他货币的官方汇率，也不规定汇率波动的幅度，听任汇率由外汇市场供求关系自发地决定。
联系汇率制将本币与某特定外币的汇率固定下来，并严格按照既定兑换比例，使货币发行准备随时可调回所使用的货币的制度。
WBGT介绍ppt课件
21
濕球溫度
• 將溫度計之感應部份以濕的棉心包覆在 自然通風狀況下測量
• 受風速及濕度影響 • 量程5℃-40℃ / ±0.5 ℃
22
黑球溫度
• 直徑15或4.2cm中空銅球,外層塗黑以 吸收紅外線輻射,內裝溫度計
• 測自然界之太陽輻射熱及作業場所產生 之輻射熱與風速
• 2吋黑球需加入修正因子 • 量程20℃-120℃ / ±1 ℃
減少發汗
體溫升高
停
汗
熱暈厥 熱浮腫 熱痙攣 缺鹽熱衰竭
缺水熱衰竭
無汗熱衰竭
中
暑
9
體溫調節功能異常
• 起疹－汗腺堵塞 • 抽筋－缺少鹽分 • 衰竭 • 昏厥 • 中暑/死亡
請不要忽略中暑的危險性!
10
高溫危害對人體生理之影響
• 熱衰竭 • 熱痙攣 • 熱中暑
11
熱衰竭/Heat Exhaustion
23
乾球溫度
• 以溫度計量取周圍空氣之溫度 • 溫度計應加遮蔽以避免輻射熱影響 • 量程10 ℃ -60 ℃ / ±0.5 ℃
24
WBGT指數的計算公式
• 室外具日曬
WBGT=濕球溫度x0.7+黑球溫度x0.2+乾球溫度x0.1
• 室內或室外無日曬
WBGT=濕球溫度x0.7+黑球溫度x0.3
25
皮膚血液循環：
-皮膚血液循環加速，使皮膚平均溫度升高。
-皮膚血液流量與(人體溫度-皮膚平均溫度)
之差值成反比，與代謝率成正比。
8
熱危害疾病演變過程
正常熱調節
熱危害
由輻射及蒸 發散熱或減 少熱吸收
皮膚溫度上升
使體內熱能 傳至體表面
血管擴張
濕球溫度
• 將溫度計之感應部份以濕的棉心包覆在 自然通風狀況下測量
• 受風速及濕度影響 • 量程5℃-40℃ / ±0.5 ℃
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黑球溫度
• 直徑15或4.2cm中空銅球,外層塗黑以 吸收紅外線輻射,內裝溫度計
• 測自然界之太陽輻射熱及作業場所產生 之輻射熱與風速
• 2吋黑球需加入修正因子 • 量程20℃-120℃ / ±1 ℃
減少發汗
體溫升高
停
汗
熱暈厥 熱浮腫 熱痙攣 缺鹽熱衰竭
缺水熱衰竭
無汗熱衰竭
中
暑
9
體溫調節功能異常
• 起疹－汗腺堵塞 • 抽筋－缺少鹽分 • 衰竭 • 昏厥 • 中暑/死亡
請不要忽略中暑的危險性!
10
高溫危害對人體生理之影響
• 熱衰竭 • 熱痙攣 • 熱中暑
11
熱衰竭/Heat Exhaustion
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乾球溫度
• 以溫度計量取周圍空氣之溫度 • 溫度計應加遮蔽以避免輻射熱影響 • 量程10 ℃ -60 ℃ / ±0.5 ℃
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WBGT指數的計算公式
• 室外具日曬
WBGT=濕球溫度x0.7+黑球溫度x0.2+乾球溫度x0.1
• 室內或室外無日曬
WBGT=濕球溫度x0.7+黑球溫度x0.3
25
皮膚血液循環：
-皮膚血液循環加速，使皮膚平均溫度升高。
-皮膚血液流量與(人體溫度-皮膚平均溫度)
之差值成反比，與代謝率成正比。
8
熱危害疾病演變過程
正常熱調節
熱危害
由輻射及蒸 發散熱或減 少熱吸收
皮膚溫度上升
使體內熱能 傳至體表面
血管擴張
蛋白质印迹课件
常用的固定化膜： NC膜（硝酸纤维素膜）和 PVDF膜。
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
《蛋白质印迹》PPT课件
优点
硝酸纤维素膜
(nitrocellulose filter membrane，NC膜)
1. 蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有较强的结合能力（80－100ug/cm2)。 2. 适用于各种显色方法，
同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、荧光显色； 3.背景低，信噪比高。 4. 转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间。
分离很宽分子量范围（6200KD）的蛋白质
适于分离小分子蛋 白质（10KD）
《蛋白质印迹》PPT课件
蛋白分子量标准 (marker)
未染色 marker
是最简单,最准确的marker。由于没有附带染料分子或者是标记 分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。
现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋 白比较。
Schleicher & Schull公司的实验表明，转移到NC膜上的蛋白4℃条件下保存5年依 然保持免疫识别特性，可以得到清晰可信的Western Blot结果。
《蛋白质印迹》PPT课件
➢ PAGE胶的孔径随 “Bis～Arc” 比率的增加而变小， ➢ 比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 ➢ SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc” 为1：29 配
制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的 蛋白质。
《蛋白质印迹》PPT课件
凝胶浓度与蛋白分离范围
考马斯亮蓝G-250与 高 蛋白质结合呈蓝色， （约1～ 在波长595nm吸收峰， 5μg/ml）, 在一定的范围内与蛋
白质的含量呈线性关 系
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS 等去污剂的影响
WB步骤详解ppt课件
度可加20l样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。加足够的电泳液后开始
准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加
样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加
入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染
最新编辑ppt
16
电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电泳
至溴酚兰刚跑出即可终止电最新泳编辑。ppt
17
取出转移槽
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18
取下玻璃板
最新编辑ppt
19
两块玻璃板都已经取下
最新编辑ppt
20
要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反 复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心， 玻板很易裂。）
合起夹子
最新编辑ppt
26
将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面 对槽的红面。
最新编辑ppt
27
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
最新编辑ppt
28
加上转移缓冲液
最新编辑ppt
29
盖上盖子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋
最新编辑ppt
30
电转移200mA 2-3h后，打开盖子，取出夹子
14
向内槽中加电泳缓冲液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，
就要重新把玻板查好，使内外不交通。 电泳液至少要漫过内
侧的小玻璃板。
最新编辑ppt
15
测完蛋白含量后，所有蛋白样品调至等浓度后上样。取出上样样品至0.5ml离心管中，
加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限
WB原理流程 ppt课件
ppt课件
20
背景太高
原因
膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交 叉反应 5. 抗体浓度过高
1. 1. 2.
对 策
3. 4.
转膜前用转移缓冲液将膜 完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
ppt课件
5
蛋白样品制备的注意事项：
细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液，加 loading煮样5min
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺
30%（29:1） SDS（10%） Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯
酰胺和双丙烯酰胺的聚合）
（Arc-Bis）。
过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由 基）
ppt课件
7
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
ppt课件
15
抗体保存注意事项：
1.收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！ 2.对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于 10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到 蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液 保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影 响的。 4.长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染 任何时候，绝对避免反复冻融！
WB工艺技术ppt课件
中的数量多于离子，因此自由基在等离子体中发挥着重要作用，自 由基的作用主要表现在化学反应过程中能量传递的“活化”作用， 处于激发状态的自由基具有较高的能量，因此易与物质表面分子结 合时形成新的自由基，新形成的自由基同样处于不稳定的高能量状 态，很可能发生分解反应，再变成较小分子的同时生成新的自由基， 这种反应过程还可能继续进行下去，最后分解成水、二氧化碳之类 的简单分子。在另一些情况下，自由基与物质表面分子结合的同时， 会释放出大量的结合能，这种能量又成为引发新的表面反应推动力， 从而引发物质表面上的物质发生化学反应而被除去。
14
(3)等离子体清洗铜引线框架 引线框架封装仍是目前封装的主流，铜合金由于具有良好的
导热性能、电性能、加工性能以及较低的价格被用作主要的引线框 架材料。但是铜的氧化物和其他的一些污染物会造成模塑料与铜引 线框架分层，降低器件的可靠性，进而影响到芯片粘接和引线键合 的质量。因此保持引线框架的清洁是保证封装可靠性重要的一步。
6
（2）化学反应 在化学反应里常用的气体有氢气（H2）、氧气（O2
）、甲烷（CF4）等，这些气体在电浆内反应成高活性的 自由基，这些自由基会进一步与材料表面作反应。其反应 机理主要是利用等离子体里的自由基来与材料表面做化学 反应，在压力较高时，对自由基的产生较有利，所以若要 以化学反应为主时，就必须控制较高的压力来近进行反应 。例如氧气等离子体形成过程如下：
15
(4) 陶瓷封装电镀前等离子体清洗 陶瓷封装中通常使用金属浆料印制线作键合区、盖板
密封区。在这些材料的表面电镀Ni、Au前采用等离子体清 洗，可去掉有机物沾污，明显提高镀层质量。
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2.1.4 结论
湿法清洗虽然在现有的微电子封装生产中占据主要地位，但是 其带来的环境以及原料消耗问题不容忽视。而作为干法清洗中最有 发展潜力的等离子体清洗，则具有不分材料类型均可进行清洗、清 洗质量好、对环境污染小等优点。等离子体清洗技术在微电子封装 中具有广泛的应用，主要用于去除表面污物和表面刻蚀等，工艺的 选择取决于后序工艺对材料表面的要求、材料表面的原有特征、化 学组成以及表面污染物性质。将等离子体清洗引入微电子封装中， 能够显著改善封装质量和可靠性。但是采用不同的工艺，对键合特 性、引线框架的性能等的影响有很大差异。例如，对铝键合区采用 氩氢等离子体清洗一段时间后，键合区的粘接性能有明显提高，但 是过长的时间也会对钝化层造成损害；对焊盘采用物理反应机制等 离子体清洗会造成“二次污染”，反而降低了焊盘的表面特性；对 铜引线框架采用两种不同机制的等离子清洗，拉力测试的结果有很 大差异。因此，选择合适的清洗方式和清洗时间，对提高封装质量 和可靠性是十分重要的。
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(3)等离子体清洗铜引线框架 引线框架封装仍是目前封装的主流，铜合金由于具有良好的
导热性能、电性能、加工性能以及较低的价格被用作主要的引线框 架材料。但是铜的氧化物和其他的一些污染物会造成模塑料与铜引 线框架分层，降低器件的可靠性，进而影响到芯片粘接和引线键合 的质量。因此保持引线框架的清洁是保证封装可靠性重要的一步。
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（2）化学反应 在化学反应里常用的气体有氢气（H2）、氧气（O2
）、甲烷（CF4）等，这些气体在电浆内反应成高活性的 自由基，这些自由基会进一步与材料表面作反应。其反应 机理主要是利用等离子体里的自由基来与材料表面做化学 反应，在压力较高时，对自由基的产生较有利，所以若要 以化学反应为主时，就必须控制较高的压力来近进行反应 。例如氧气等离子体形成过程如下：
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(4) 陶瓷封装电镀前等离子体清洗 陶瓷封装中通常使用金属浆料印制线作键合区、盖板
密封区。在这些材料的表面电镀Ni、Au前采用等离子体清 洗，可去掉有机物沾污，明显提高镀层质量。
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2.1.4 结论
湿法清洗虽然在现有的微电子封装生产中占据主要地位，但是 其带来的环境以及原料消耗问题不容忽视。而作为干法清洗中最有 发展潜力的等离子体清洗，则具有不分材料类型均可进行清洗、清 洗质量好、对环境污染小等优点。等离子体清洗技术在微电子封装 中具有广泛的应用，主要用于去除表面污物和表面刻蚀等，工艺的 选择取决于后序工艺对材料表面的要求、材料表面的原有特征、化 学组成以及表面污染物性质。将等离子体清洗引入微电子封装中， 能够显著改善封装质量和可靠性。但是采用不同的工艺，对键合特 性、引线框架的性能等的影响有很大差异。例如，对铝键合区采用 氩氢等离子体清洗一段时间后，键合区的粘接性能有明显提高，但 是过长的时间也会对钝化层造成损害；对焊盘采用物理反应机制等 离子体清洗会造成“二次污染”，反而降低了焊盘的表面特性；对 铜引线框架采用两种不同机制的等离子清洗，拉力测试的结果有很 大差异。因此，选择合适的清洗方式和清洗时间，对提高封装质量 和可靠性是十分重要的。
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WB的基本步骤
蛋白质样品的制备 蛋白质的SDS-PAGE电泳 蛋白质的膜转移 封闭与抗原抗体反应 目标蛋白检测
Overview of sample types in the biomarker development
组织样本制备
处死动物
取相应 肝脏组织
-80度冻存 避免反复冻融
转印膜选择
转膜确认
丽春红S的使用 Prestain ™蛋白质预染
Markers
Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
封闭
什么叫封闭？ 加入抗体前需要将膜在封闭剂里进行封闭
为什么要封闭？ 封闭膜上的非特异性结合位点，封闭后，可以减少后续 的一抗或二抗与膜的非特异性结合，降低背景着色，提 高信噪比。 采用什么封闭？ 商业化封闭液，5%脱脂奶粉等
• Bradford法 • Lowry法 • BCA法
Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
为什么要做WB？
目标蛋白检测
目标蛋白定性定量
多目标同时检测
Marker+靶蛋白 对照（or上样量校正蛋白）+靶蛋白 总蛋白+修饰化蛋白 靶蛋白+靶蛋白 核酸+结合蛋白
双色－EMSA
700 and 800 Overlay
DNA-Protein Complex Unbound DNA IRDye 800 Unbound DNA IRDye 700
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成 “Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白 质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（如图）。
Western blotting名字由来
• 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋 白质进行印迹分析，对RNA的印迹分 析称为Northern印迹法，对单向电泳后 的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印 迹分析称为Eastern2.42 7.31 17.23 27.32 46.39
800 2.03
5.1 7.99 10.82 15.23 18.42
50
Target protein 4A0 nti-rabbit 800 channel
30
Normalizer target
2A0 nti-mouse 700 channel
Western blotting
Immunal Blotting
什么是blotting?
• 印迹法（blotting）是指将样品转移到固 相载体上，而后利用相应的探测反应来 检测样品的一种方法。
blotting起源
• 1975年，科学家Southern将DNA转移到 硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用 DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段 ，最先建立了印迹的方法(Southern blotting)。
抗原抗体反应
常通过两步法进行免疫反应：一抗（蛋白的特异性 抗体）与被检测蛋白直接结合，二抗识别一抗的种 属特异性（Fc段），二抗常带有标记物。 例：大鼠抗人P53的抗体（I抗），羊抗大鼠的抗体 （II抗）--------即X抗人，Y抗X
目标检测
双通道同时检测
Name Lane_1 Lane_2 Lane_3 Lane_4 Lane_5 Lane_6
700 nm Channel 800 nm Channel
Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).
比较液氮 研磨法和 匀浆法
细胞样本制备
细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ，
0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0
蛋白样品的定量
800 600 400 200
0 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.12 6.25 12.5 25 50 100
Concentration EGF (ng/ml)
A431 cells stimulated with serial dilutions of EGF to optimize activation of ERK1/2. Phospho-ERK signal was normalized using total ERK signal.
• 免疫印迹（western blotting）是在 蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础 上发展起来一项检测蛋白质的技术。
• 它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨 力与抗原抗体反应（ELISA）高特异性 和高敏感性相结合。
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至 一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来 检测。
双色－EGFR的磷酸化
EGF对ERK 磷酸化水平的调控
EGF Concentration Composite Image Overlay
700 nm (Total ERK)
800 nm (Phospho-ERK)
% Induction of ERK Phosphorylation
1800 1600 1400 1200 1000