植物4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)研究进展

植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展

摘要综述了4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的功能、功能与结构的关系及晶体学方面的研究进展,以期为4CL蛋白质的结构和功能的进一步研究提供依据。

关键词4-香豆酸;辅酶A连接酶;功能;研究进展

ResearchProgresson4-Coumarate:CoenzymeALigase (4CL) ofPlants

FENG Chun-yan

(College of Biological Science and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083)

AbstractIn this paper,the research progress of 4-coumarate:coenzyme A ligase(4CL)was overviewed,containing function,relationship between function and structure,and crystallography. It would provide evidence for further study on the structure and function of 4CL proteins.

Key words4-coumarate;coenzyme a ligase(4CL);function;research progress

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是木质素生物合成的关键酶之一,它位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上。4CL催化肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯,这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径[1-2]。以前的研究大都集中在各物种的4CL基因及其同工酶基因的发现和表达调控,近年来其催化反应和底物偏好选择的分子机理成为研究热点。目前的研究进展主要是通过研究功能域氨基酸位点的突变体酶蛋白的体外功能和蛋白质晶体结构模型,提出可能的分子机理。

14CL蛋白的功能研究

4CL蛋白的研究在20世纪70年代初就已经开始,最初的研究工作主要集中在分离纯化植物中的4CL蛋白酶,并对提取的天然4CL蛋白酶进行生化特性研究方面。到目前为止,已从大豆、欧芹、云杉、杨树、水稻、丝瓜、刺槐等多种植物中纯化或部分纯化出了4CL蛋白。

随着越来越多植物的4CL基因被发现,人们发现这些植物基因组中4CL基因一般以小的基因家族的形式存在,家族内不同成员可能在苯丙烷类代谢不同分支代谢途径中起作用。同时人们发现4CL基因是组织特异性表达基因,同一物种中

4CL基因家族中不同成员的表达表现出器官、组织和细胞的特异性,这可能与不同成员参与不同的分支途径有关。如美洲山杨含有结构上和功能上均不同的2个4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2,二者差异表达以调控不同的苯丙烷类衍生物的生物合成,它们参与不同的生理功能[3],Pt4CL1在正在发育的木质部组织参与木质素生物合成,而Pt4CL2在表皮细胞中参与其他酚类化合物如类黄酮的生物合成。

人们也对4CL基因的表达调控作了大量的研究。与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样,4CL基因也属于调控基因。其表达主要受发育的调控,4CL基因在植物生命世代中很早即开始表达。拟南芥4CL基因在苗期阶段即被活化,拟南芥发芽后2~3 d,4CL基因即开始表达,其活性与子叶和根部木质素沉积的起始密切相关[4]。毛白杨4CL基因的表达水平在一个生长季节中呈现“双峰”模式,即“弱—强—弱—强—弱”,分别在6月底至7月初、7月底至8月初达到峰值,与早材和晚材的形成阶段相符合[5]。4CL基因的表达还能被许多环境因子激活,如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等。4CL基因家族的不同成员对于各种环境因子的反应差异说明其在苯丙烷类衍生物代谢中具有不同的功能。

24CL蛋白的结构和功能的关系

通过对几种植物的4CL蛋白的氨基酸序列进行同源比对分析结果发现:4CL 蛋白质归类为2组,组I和组II。拟南芥At4CL1、At4CL2,杂种杨Ptd4CL1、Ptd4CL2和Pt4CL1归类为组I,拟南芥At4CL3及杨树Pt4CL2归类为组II。组I内蛋白质相互之间的关系比其与组II来自同一种植物的蛋白质之间的关系更为接近,反之亦然(反之亦然)。组II内拟南芥、杨树和大豆的4CLs主要伴随着类黄酮的生物合成,而组I内的4CLs更为主要地伴随木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成。

对4CL蛋白质序列的比对分析还表明,在所有已知的4CL氨基酸序列中存在几个保守的肽基序(motif)。肽基序Box I、SSGTTGLPKGV在4CL蛋白质序列中几乎绝对保守,而且与荧光素酶、长链脂肪酰基-CoA合成酶、肽合成酶中发现的保守基序相似。肽基序Box II、GEICIRG在所有4CL中绝对保守,其中心的C残基被认为直接参与催化进程[6]。

Schneider等[7]基于短杆菌肽S-合成酶PheA(Phenyla-lanine-activating)的晶体数据,分子模建了拟南芥At4CL2的蛋白质模型,鉴定了参与At4CL2 SBP的12个氨基酸残基,创造了“功能的获得”(Gain-of-function)突变体,通过增加SBP的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的At4CL2突变体,而通过增加SBP的疏水性导致具有强烈增强的肉桂酸转化的At4CL2突变体。

上述研究结果对于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中关键酶的催化过程,对于设计具有新的底物特异性的4CL突变体有很好的帮助。但这些都没有从根本上揭示4CL同工酶的底物特异性和偏好性的分子机制。要阐明4CL蛋白的催化机制,最佳方法就是获得4CL蛋白的晶体,并通过X-衍射收集4CL晶体的结构数据,解析4CL蛋白的原子结构,从而更好地解释4CL蛋白的结构与功能的关系。

34CL蛋白晶体学研究现状

3.1晶体生长的基本原理和方法

蛋白质晶体生长的基本原理是指蛋白质溶液在过饱和状态下,蛋白质在固相沉积的速率大于离开固相进入液相的速率时,溶液中蛋白质分子就会自我聚集成核,在合适的条件下,形成的晶核发育成蛋白质晶体。蛋白质晶体通常在过饱和状态下出现,蛋白质能达到过饱和状态而不是在达到饱和态就立即沉淀或者结晶出来,主要是因为蛋白质结晶也有类似于化学反应的能垒,成核是一个高能态,使得蛋白质成核过程较慢。能垒越高,蛋白质形成临界核的速度就越慢,过饱和状态就越容易维持。同时蛋白质溶液过饱和状态越高,蛋白质形成临界核的可能性就越大。结晶的方法分为4种:批量结晶、蒸发结晶、液液扩散结晶和透析结晶[8]。

3.2蛋白质晶体解析方法

蛋白质空间结构与其生物活性的关系是结构生物学的核心。空间结构对酶的功能至关重要,即使极其细微的扰乱也会导致酶活力的丧失。结构与功能关系的研究,一直是蛋白质研究的核心问题之一。1960年Max Perutz解析出了第1个蛋白质结构——血红蛋白质的三维结构。这之后蛋白质结构解析工作逐渐开展起来[9]。蛋白质晶体结构测定可以提供原子(或接近)分辨率的三维精细结构。经过修正的高于1■分辨率的蛋白质结构,可以确定其结构中的原子的空间坐标及原子之间的关系(如氢键)、结构表面及内部的溶剂分布,以及分子柔性或运动的变化[10]。目前,可用于完整、准确、实时测定生物大分子三维结构的主要方法包括:X射线晶体结构分析、多维核磁共振(NMR)波谱解析和电子显微镜二维晶体三维重构(电子晶体学,EC)。

3.3蛋白质结晶影响因素

X射线衍射是确定所有分子三维空间结构最可靠的方法之一,而获得合适的晶体是进行X射线衍射的基本前题。结构测定往往由于得不到高质量的晶体而受到阻碍。蛋白质结晶的影响因素有:结晶蛋白质的纯度、过饱和度、温度、pH 值、结晶剂、压力、外加物理场,其他因素包括:蛋白质结晶液的浓度、蛋白质的来源、细菌及真菌引起的污染程度、样品体积及氧化—还原环境等。对于蛋白质的结晶,结晶剂的作用主要在于对溶剂产生影响而对蛋白质分子不产生影响。一般来说,结晶剂主要有盐类,如磷酸盐、硫酸盐等,以及高分子直链聚合物,如PEG 等。新近发展的高通量蛋白质结晶技术,可以同时进行数千个蛋白质结晶条件实验,大大减少了优化结晶条件的时间,加速了蛋白质结构研究的速度[11]。

近几年来,国际上有几个实验室同时对4CL的结构及其功能关系进行深入地研究,获得了一系列有关4CL蛋白晶体结构与功能之间关系的信息。但到目前为止,没有获得任何一个物种的4CL蛋白晶体的三维结构。

4存在问题与展望