硫酸粘菌素含量测定HPLC

硫酸粘菌素（ST ）含量检查法
1. 色谱系统
色谱柱：Develosil ODS-UG-3 ，5μm ，4.6×150mm
柱温：25℃
检测波长：215nm
进样量：20μl
流动相：乙腈∶硫酸盐缓冲液=22∶78
流速：1.0ml/min
运行时间：30分钟
相对于ColistinE1的相对保留时间，ColistinE2大约为0.45，ColistinE3大约为0.5， ColistinE1-I 大约为0.8，ColistinE1-7MOA 大约为1.1。

2. 系统适应性：
――分离度：在ColistinE3和ColistinE1之间的峰的分离不得低于8.0，在ColistinE2和 ColistinE1-I 之间的峰的分离不得低于6.0，在ColistinE1-I 和ColistinE1之间的峰的分 离不得低于2.5，在ColistinE1和ColistinE1-7MOA 之间的峰的分离不得低于1.5。

3. 试液：硫酸盐缓冲液：精密称取无水硫酸钠
4.46g ，用900ml 超纯水溶解，加入2.5ml 磷酸，调
节pH 至2.3～2.5，再加水成1000ml
4. 流动相：混合22体积的乙腈和78体积的硫酸盐缓冲液。

5. 试验方法
a. 标准对照溶液：溶解25.0mg 硫酸粘菌素CRS3于40ml 水中，用乙腈稀释至50.0ml 。

（具体操作见附页）
b. 样品溶液（n ＝3）：精密称取样品25.0±1mg 于50ml 容量瓶中，加入超纯水40ml 溶解，用乙腈稀释至50.0ml 。

（10%预混剂样品要适当增大样品量，500mg 溶解至100ml ）
c. 进样：对照溶液进样6次，样品溶液各进样1次，对照溶液再进样3次，记录色谱图。

d. 计算：用标准对照溶液的色谱及硫酸粘菌素CRS3标示的含量分别计算Colistins E1、E2、E3、E1-I 和E1-7MOA 总和的百分含量，Colistins E3的百分含量，Colistins E1-I 的百分含量，Colistins E1-7MOA 的百分含量。

对照品对应组分含量－水分）
（含量样标标样⨯⨯⨯⨯=1%组分C A C A 其中： A 样为组分峰面积
A 标为标准品对照中与A 样对应的峰面积
C 标为标准对照品溶液浓度（mg/ml ）
C 样为样品溶液浓度（mg/ml ）
e. 判断：E1、E2、E3、E1-I 、E1-7MOA 合计 ≥77.0％；
E 3≤10.0％ E1-I ≤10.0％ E1-7MOA ≤10.0％
附页：
硫酸粘菌素含量测定标准对照液的配制程序
1. 在干净的烧杯中装入40ml水。

2. 打开CRS标准品瓶铝盖中心，中间为橡胶内盖。

3. 将短针头刺入橡胶内盖，针头稍微露出内盖，作为抽气用。

4. 用带长针头（确保针头有足够的长度能刺到瓶底）的注射器从装有40ml水的烧杯中
吸取5ml水注入CRS标准品中。

5. 缓慢溶解标准品瓶内粉末，这个阶段，不可翻转标准品瓶。

6. 尽量抽出CRS标准品瓶内溶液，移至容量瓶中。

针拔出时注意使橡胶盖上无水滴残
留，如果有水滴残留，用注射器回收。

7. 从烧杯中再次吸取5ml水加入标准品瓶中，拔出所有针头翻转CRS标准品瓶，使橡
胶盖附着粉末全部溶解。

8. 刺入抽气用针头和吸取用注射器，抽取CRS标准品瓶内液体，移至容量瓶中。

9. 重复7、8步骤至吸完40ml水为止。

10. 加入乙腈9ml（刻度线以下），充分混合。

11. 用乙腈定容至50ml，充分混合。

12. 溶液用塑料进样瓶分装，放在－30℃下保存。

在干净的烧杯中装入40ml 水。

· 打CRS 标准品瓶铝盖中心，将短针刺入橡胶内盖。

用带长针头的注射器从烧杯中吸取5ml 水注入到CRS 标准品瓶中。

缓慢溶解标准品瓶内液体，移至容量瓶中。

尽量抽出CRS 标准品瓶内液体，移至容量瓶中。

再次吸取5ml 水加入标准品瓶中，拔出所有针头，翻转CRS 标准品瓶，使橡胶盖附着粉末全部
刺入抽气用针头和吸取用注射器，抽取CRS 标准品瓶内液体，移至容量瓶中。

重复二次溶解步骤至吸完40ml 水为止。

加入乙腈9ml （刻度以下），充分混合。

用乙腈定容至50ml ，充分混合。

溶液用塑料进样瓶分装，放在－30℃下保存。

溶剂
准备 一次溶解
移液
二次溶解
重复
移液
混合
定容
分装储存。