细胞生物学 第二章细胞生物学研究方法
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• 用途：观察细胞或组 织的表面立体结构。
§1 细胞形态结构的观察方法
三、扫描隧道显微镜 （Scanning tunneling microscope，STM）
• 于1981年发明，发明者获 1986年度诺贝尔物理学奖。
• 特点： ①具有原子尺度的高分辨力，
侧（横）分辨率为0.1-0.2nm， 纵分辨率0.001nm； ②除在真空外，还可在空气、 液体等条件下观察； ③非破坏性测量：不受电子 束的轰击、破坏。
• 因此，可用已知的抗体检测未知的抗原。
• 但多数抗原-抗体结合后不出现可见反应，即不能检测 到二者的这种特异性结合。如何检测抗原-抗体发生了 结合反应？
• 用一种可见的标记物标记抗体，通过检测标记物的存
在与否判断抗原-抗体是否发生了结合反应——免疫标
记技术。
抗原
标记物
抗体
二、特异蛋白抗原的定位与定性
s 将二次电子收集并经一系列 的处理在荧光屏上成像。
s 这样，可以得到样品表面的 立体图像。
二、电子显微镜
• 扫描电镜的样品制备：
s 取材； s 固定； s 脱水； s 临界点干燥； s 喷镀； s 电镜观察。
• 分辨本领：较低，一般 在3nm。
• 放大倍数：几万倍。
二、电子显微镜
• 特点：成像具有立体 感。
• 可见光的波长400700nm。
• 光学显微镜的最大分辨 率为0.2μm。
一、光学显微镜
• 光镜样品制备： 石蜡包埋切片， 苏木精-伊红染色。
一、光学显微镜
（二）相差显微镜和微分 干涉显微镜
• 原理：利用显微镜中的 特殊装置，使光线通过 样品时波长和振幅发生 变化，以增大样品明暗 的反差。
• 用途：这两种显微镜可 用于观察未染色的活细 胞的细胞结构及其动态 变化。
大鼠脑细胞膜上的K+通道蛋白
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（三）免疫印迹技术（Western blotting） • 原理与步骤：
SDS凝胶电泳把蛋白质混合物分开 通过扩散或电泳 转移到纤维素膜上，形成一个凝胶复制品
（印迹）
在滤膜上加标记物标记的抗体
检测是否出现标记物
• 用途：体外对某蛋白条带进行定性分析。 • 动画
二、电子显微镜
（二）主要电镜制样技术
• 电镜在生命科学中的应用， 不仅仅依靠电镜本身具有 高分辨率和高放大倍数， 同时还得依赖各种各样的 生物样品制备技术。
• 即，高性能的电镜仅是用 于观察的工具，而要取得 观察的效果则需依赖各种 生物样品制备技术。
二、电子显微镜
1、（树脂包埋）超薄切片技术 ——石蜡包埋切片技术，其处理过程和原理都是一致
的。 • 不同点： s 包埋剂是树脂——因被切的生物样品既需要一定刚
性又需要一定韧性； s 由于电子的穿透能力很弱，因此要把切片做的很薄，
40-50nm。 如：一个动物细胞（20μm）要切出400片（石蜡包埋 切片技术5-8μm，切出4片），所以称超薄切片。
二、电子显微镜
（1）超薄切片技术的处理 过程：
流 感 病 毒
新 冠 病 毒
二、电子显微镜
3、冷冻蚀刻技术
• 原理与过程：
s 将样品在-196℃的液氮中低 温冷冻，然后用刀将其骤然 断开——多在膜脂双分子层 的疏水端；
s 当温度上升后，冰在真空中 升华，断面上凹凸不平类似 浮雕的结构得以暴露——蚀 刻。
二、电子显微镜
s 用重金属铂等对样品的断面进 行倾斜喷镀，形成对应于凹凸 断裂面的电子反差；
异性与荧光的敏感性相结 合。 • 用途：在光镜（荧光显微 镜）下，即在细胞（或显 微）水平上定性、定位蛋 白质抗原，如微管蛋白。
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（二）免疫电镜技术
• 标记物：电子致密物质如 铁蛋白、胶体金等。
• 检测工具：电镜
• 特点：抗原抗体反应的特 异性与电镜的高分辨率相 结合。
• 用途：在电镜下，即亚细 胞（或亚显微）水平上定 性、定位蛋白质抗原。
三、扫描隧道显微镜
• 用途：主要用于分子水 平结构的观察，可观察 DNA、RNA、蛋白质等 生物大分子以及生物膜、 病毒等结构。
§2 细胞及其组分的分析方法
一、用超离心技术分离细胞组分
细胞
低渗、超声粉碎、研磨
细胞匀浆
超离心
一、用超离心技术分离细胞组分
• 超离心：
s 差速离心：由低到高的转速 下，质量或密度大的组分先 沉到管底而得到分离；
ATCCGAATT TAGGCTTAA
三、细胞内特异核酸的定位与定性
（一）原位杂交技术
（in situ hybridization）
• 用标记的核酸探针通过分子杂 交确定特异核苷酸序列在染色 体上或在细胞中的位置的方法。
• 标记物：荧光素，电子致密物 质，放射性同位素，等。
胞，电泳条带等； s 免疫染色：加入已知的标记抗
体与样品中的待检抗原孵育， 以使它们发生专一性的结合； s 检测标记物。
• 这样，通过标记物的有无判断待检抗原是否存在— —定性，通过标记物的位置判断待检抗原的分布— —定位，通过标记物的多少判断待检抗原的含量— —定量。
• 用于检测组织细胞中的蛋白质抗原如酶、激素、受 体、信号蛋白等的分布、含量、转归等。
一、光学显微镜
（三）荧光显微镜
• 原理：以紫外光为光源， 用以照射被检组织细胞， 其中的荧光素（常作为 标记物）被激发而发出 荧光，从而显示相关成 分的存在。
• 用途：显微水平上对某 些成分（主要是蛋白质） 进行定性和定位研究。
一、光学显微镜
（四）激光扫描共焦显微镜
• 原理：在荧光显微镜成像基础 上，配置激光光源和扫描装置， 并采用共轭聚焦装置，利用计 算机进行图像处理，对观察样 品进行断层扫描和成像。
§2 细胞及其组分的分析方法
三、细胞内特异核酸的定位与定性 • 基本原理：分子杂交
DNA双链 变性 复性或杂交 互补的DNA单链 • 杂交反应：可以在两条具有互补 序列的单链核苷酸分子中进行， 即DNA - DNA、RNA - RNA、 DNA - RNA。 • 因此，可用已知核苷酸序列的一 条链，检测与之互补的另外一条 链。 • 因不出现可见反应，故也需通过 标记物显示。
§1 细胞形态结构的观察方法
二、电子显微镜 （一）电子显微镜基本知识 • 分类：
s 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）
s 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）
• 两者的原理及用途不同。 通常所说的电镜指透射电 镜。
s 密度梯度离心：不同密度组 分在离心管内形成不同的沉 降带。包括速度沉降和等密 度沉降。
• 从而分离出细胞核、核仁、 线粒体、溶酶体、高尔基体、 核糖体、质粒等细胞器或生 物大分子。
§2 细胞及其组分的分析方法
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 基本原理：免疫学技术——抗原（蛋白质），抗体
• 免疫学技术的特点：对应的抗原、抗体能特异性结合。
——有多种标记物，其检测 工具与方法各不相同
• 根据标记物及其检测方法的不同，免疫标记技术 可分为以下类型：
荧光素——免——免疫电镜技术 酶——免疫酶技术
放射性同位素——放射免疫测定法
化学发光物质——发光免疫测定法
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 免疫标记技术的基本步骤： s 制备样品：切片，单层培养细
• 其三维结构图像接近原子尺度的分辨率，人类第 一次可以在显微镜下看清楚接近天然状态的生物 大分子的精细结构。
• 2017年诺贝尔化学奖颁给杜波切特、弗兰克和亨 德森，表彰他们发展了低温电镜技术。
二、电子显微镜
5、扫描电镜技术
• 原理：
s 电子束在样品表面进行扫描， 激发样品表面放出二次电子。 二次电子产生的多少与电子 入射角度有关，即与样品表 面的立体形貌有关。
第二章 细胞生物学研究方法
§1 细胞形态结构的观察方法 §2 细胞及其组分的分析方法 §3 细胞培养与细胞工程 （§4 细胞及生物大分子的动态变化 §5 模式生物与功能基因组的研究 ）
§1 细胞形态结构的观察方法
• 细胞形态结构的观察——利用各种显微镜技术。
光学显微镜、电子显微镜和扫瞄隧道显微镜的分辨范围
• 是电镜技术、电子衍射技 术与计算机图像处理技术 相互结合的一种技术。
• 原理：用电镜对样品从不 同的倾角拍照，然后用计 算机将系列照片进行处理， 从而展现其三维结构图。
• 用途：研究生物大分子的 三维结构。
二、电子显微镜
• 低温电镜技术：将样品直接冷冻处理，在低温下 使用透射电子显微镜观察样品的显微技术。
• 特点：可通过改变焦点获得细 胞的不同切面——“光学切 片”，然后经过叠加得到细胞 的三维结构。
• 用途：研究细胞内结构及组分 的定性和定位。
• 是现代最先进的细胞生物学研 究仪器之一。
一、光学显微镜
（五）倒置显微镜 • 与普通光镜相反，其光源
与物镜的位置是倒置的。 即光源在上方，物镜在载 物台的下方。 • 特点：工作距离长；影像 是正的。 • 用途：主要用于观察培养 瓶或培养皿中的活细胞； 用于显微操作。
二、电子显微镜
• 显微镜的分辨率与光源有关。
• 由于光镜的可见光波长 （400nm）的原因，使光镜分 辨率无法突破0.2μm这一极限。
• 小于0.2μm的细微结构，即使 再放大倍数也无法看清。这些 细微结构称为亚显微结构或超 微结构。
• 要想看清这些结构就必须提高 显微镜的分辨率。
• 要提高分辨率就得选择波长更 短的光源。
• 取材：0.5mm³； • 固定：戊二醛和锇酸； • 脱水：系列丙酮或乙醇； • 浸透、包埋：环氧树脂； • 切片：用超薄切片机；刀
为玻璃刀（或钻石刀）； 切片捞在金属网上； • 染色：用重金属盐如醋酸 双氧铀和柠檬酸铅染色； • 电镜观察。
二、电子显微镜
（2）超薄切片技术的用途
• 为电镜技术的基础。几乎所有 的细胞超微结构可以用超薄切 片技术在电镜下显示出来。
• 分别用于观察显微结构、亚显微结构和生物大分子结构。
§1 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 （一）普通复式光学显
微镜 • 以可见光作光源。 • 构造与使用 • 评价显微镜优劣的指
标？
一、光学显微镜
• 分辨率：能区分开两个
质点间的最小距离。
D
0.61 N sin
2
λ—光源波长；N —介质折射 率；α—物镜镜口角。
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 根据标记抗体与抗原结合的方式和关系，免疫 标记技术可分为直接法和间接法。
一抗
二抗 一抗
样品
直接法
间接法
• 多应用间接法——敏感性提高；一种标记二抗 可检测多种未知抗原
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（一）免疫荧光技术 • 标记物：荧光素 • 检测工具：荧光显微镜 • 特点：抗原抗体反应的特
D
0.61 N sin
2
二、电子显微镜
• 电镜的光源：电子束。 • 其波长为0.01-0.9nm，比
可见光（400nm）波长短 1000倍，所以其理论分辨 本领为0.1-0.2nm，实际分 辨率为5nm。 • 其放大倍数为几万-几十 万倍（106倍）。
D
0.61 N sin
2
二、电子显微镜
s 再用碳在断面上进行垂直喷镀， 形成一连续碳膜；
s 用消化液将样品本身消化掉； s 最终只剩下一层由重金属形成
影像的碳膜——复型膜——反 映了样品断面的自然形态； s 电镜下观察复型膜。
二、电子显微镜
• 用途：观察膜断裂面的蛋 白质颗粒和膜表面结构。
二、电子显微镜
4、电镜三维重构与低温电镜 技术
• 另外，在超薄切片上还可以进 行免疫反应（抗原抗体反应）、 原位杂交、放射自显影、细胞 化学等，从而在亚显微水平上 对生物大分子进行定性、定位 和动态研究。
二、电子显微镜
2、负染色技术 • 原理：在样品上直接滴加染
料如磷钨酸进行染色，吸去 染料、样品干燥后，残余染 料沉积在样品的周围、凹陷、 空隙处，而样品本身反而呈 浅色，故名负染色。 • 特点：简便；分辨率很高， 可达1.5nm。 • 用途：用于观察本身大小即 允许电子束穿透而不经切片 的样品，如病毒、核糖体、 蛋白质纤维等。
• 电镜和光镜的区别： s 光源不同； s 电镜的透镜为电磁透镜
（光镜为玻璃透镜）； s 电镜的镜筒需要真空，因
此电镜的缺陷是不能观察 活的生物样品。 s 电子像是人眼直接看不见 的，因此它是投射到荧光 屏上以便观察，或是用感 光胶片或CCD记录下来； s 由于电镜的光源是电子束， 故其图像和照出来的照片 均是黑白的。
§1 细胞形态结构的观察方法
三、扫描隧道显微镜 （Scanning tunneling microscope，STM）
• 于1981年发明，发明者获 1986年度诺贝尔物理学奖。
• 特点： ①具有原子尺度的高分辨力，
侧（横）分辨率为0.1-0.2nm， 纵分辨率0.001nm； ②除在真空外，还可在空气、 液体等条件下观察； ③非破坏性测量：不受电子 束的轰击、破坏。
• 因此，可用已知的抗体检测未知的抗原。
• 但多数抗原-抗体结合后不出现可见反应，即不能检测 到二者的这种特异性结合。如何检测抗原-抗体发生了 结合反应？
• 用一种可见的标记物标记抗体，通过检测标记物的存
在与否判断抗原-抗体是否发生了结合反应——免疫标
记技术。
抗原
标记物
抗体
二、特异蛋白抗原的定位与定性
s 将二次电子收集并经一系列 的处理在荧光屏上成像。
s 这样，可以得到样品表面的 立体图像。
二、电子显微镜
• 扫描电镜的样品制备：
s 取材； s 固定； s 脱水； s 临界点干燥； s 喷镀； s 电镜观察。
• 分辨本领：较低，一般 在3nm。
• 放大倍数：几万倍。
二、电子显微镜
• 特点：成像具有立体 感。
• 可见光的波长400700nm。
• 光学显微镜的最大分辨 率为0.2μm。
一、光学显微镜
• 光镜样品制备： 石蜡包埋切片， 苏木精-伊红染色。
一、光学显微镜
（二）相差显微镜和微分 干涉显微镜
• 原理：利用显微镜中的 特殊装置，使光线通过 样品时波长和振幅发生 变化，以增大样品明暗 的反差。
• 用途：这两种显微镜可 用于观察未染色的活细 胞的细胞结构及其动态 变化。
大鼠脑细胞膜上的K+通道蛋白
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（三）免疫印迹技术（Western blotting） • 原理与步骤：
SDS凝胶电泳把蛋白质混合物分开 通过扩散或电泳 转移到纤维素膜上，形成一个凝胶复制品
（印迹）
在滤膜上加标记物标记的抗体
检测是否出现标记物
• 用途：体外对某蛋白条带进行定性分析。 • 动画
二、电子显微镜
（二）主要电镜制样技术
• 电镜在生命科学中的应用， 不仅仅依靠电镜本身具有 高分辨率和高放大倍数， 同时还得依赖各种各样的 生物样品制备技术。
• 即，高性能的电镜仅是用 于观察的工具，而要取得 观察的效果则需依赖各种 生物样品制备技术。
二、电子显微镜
1、（树脂包埋）超薄切片技术 ——石蜡包埋切片技术，其处理过程和原理都是一致
的。 • 不同点： s 包埋剂是树脂——因被切的生物样品既需要一定刚
性又需要一定韧性； s 由于电子的穿透能力很弱，因此要把切片做的很薄，
40-50nm。 如：一个动物细胞（20μm）要切出400片（石蜡包埋 切片技术5-8μm，切出4片），所以称超薄切片。
二、电子显微镜
（1）超薄切片技术的处理 过程：
流 感 病 毒
新 冠 病 毒
二、电子显微镜
3、冷冻蚀刻技术
• 原理与过程：
s 将样品在-196℃的液氮中低 温冷冻，然后用刀将其骤然 断开——多在膜脂双分子层 的疏水端；
s 当温度上升后，冰在真空中 升华，断面上凹凸不平类似 浮雕的结构得以暴露——蚀 刻。
二、电子显微镜
s 用重金属铂等对样品的断面进 行倾斜喷镀，形成对应于凹凸 断裂面的电子反差；
异性与荧光的敏感性相结 合。 • 用途：在光镜（荧光显微 镜）下，即在细胞（或显 微）水平上定性、定位蛋 白质抗原，如微管蛋白。
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（二）免疫电镜技术
• 标记物：电子致密物质如 铁蛋白、胶体金等。
• 检测工具：电镜
• 特点：抗原抗体反应的特 异性与电镜的高分辨率相 结合。
• 用途：在电镜下，即亚细 胞（或亚显微）水平上定 性、定位蛋白质抗原。
三、扫描隧道显微镜
• 用途：主要用于分子水 平结构的观察，可观察 DNA、RNA、蛋白质等 生物大分子以及生物膜、 病毒等结构。
§2 细胞及其组分的分析方法
一、用超离心技术分离细胞组分
细胞
低渗、超声粉碎、研磨
细胞匀浆
超离心
一、用超离心技术分离细胞组分
• 超离心：
s 差速离心：由低到高的转速 下，质量或密度大的组分先 沉到管底而得到分离；
ATCCGAATT TAGGCTTAA
三、细胞内特异核酸的定位与定性
（一）原位杂交技术
（in situ hybridization）
• 用标记的核酸探针通过分子杂 交确定特异核苷酸序列在染色 体上或在细胞中的位置的方法。
• 标记物：荧光素，电子致密物 质，放射性同位素，等。
胞，电泳条带等； s 免疫染色：加入已知的标记抗
体与样品中的待检抗原孵育， 以使它们发生专一性的结合； s 检测标记物。
• 这样，通过标记物的有无判断待检抗原是否存在— —定性，通过标记物的位置判断待检抗原的分布— —定位，通过标记物的多少判断待检抗原的含量— —定量。
• 用于检测组织细胞中的蛋白质抗原如酶、激素、受 体、信号蛋白等的分布、含量、转归等。
一、光学显微镜
（三）荧光显微镜
• 原理：以紫外光为光源， 用以照射被检组织细胞， 其中的荧光素（常作为 标记物）被激发而发出 荧光，从而显示相关成 分的存在。
• 用途：显微水平上对某 些成分（主要是蛋白质） 进行定性和定位研究。
一、光学显微镜
（四）激光扫描共焦显微镜
• 原理：在荧光显微镜成像基础 上，配置激光光源和扫描装置， 并采用共轭聚焦装置，利用计 算机进行图像处理，对观察样 品进行断层扫描和成像。
§2 细胞及其组分的分析方法
三、细胞内特异核酸的定位与定性 • 基本原理：分子杂交
DNA双链 变性 复性或杂交 互补的DNA单链 • 杂交反应：可以在两条具有互补 序列的单链核苷酸分子中进行， 即DNA - DNA、RNA - RNA、 DNA - RNA。 • 因此，可用已知核苷酸序列的一 条链，检测与之互补的另外一条 链。 • 因不出现可见反应，故也需通过 标记物显示。
§1 细胞形态结构的观察方法
二、电子显微镜 （一）电子显微镜基本知识 • 分类：
s 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）
s 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）
• 两者的原理及用途不同。 通常所说的电镜指透射电 镜。
s 密度梯度离心：不同密度组 分在离心管内形成不同的沉 降带。包括速度沉降和等密 度沉降。
• 从而分离出细胞核、核仁、 线粒体、溶酶体、高尔基体、 核糖体、质粒等细胞器或生 物大分子。
§2 细胞及其组分的分析方法
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 基本原理：免疫学技术——抗原（蛋白质），抗体
• 免疫学技术的特点：对应的抗原、抗体能特异性结合。
——有多种标记物，其检测 工具与方法各不相同
• 根据标记物及其检测方法的不同，免疫标记技术 可分为以下类型：
荧光素——免——免疫电镜技术 酶——免疫酶技术
放射性同位素——放射免疫测定法
化学发光物质——发光免疫测定法
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 免疫标记技术的基本步骤： s 制备样品：切片，单层培养细
• 其三维结构图像接近原子尺度的分辨率，人类第 一次可以在显微镜下看清楚接近天然状态的生物 大分子的精细结构。
• 2017年诺贝尔化学奖颁给杜波切特、弗兰克和亨 德森，表彰他们发展了低温电镜技术。
二、电子显微镜
5、扫描电镜技术
• 原理：
s 电子束在样品表面进行扫描， 激发样品表面放出二次电子。 二次电子产生的多少与电子 入射角度有关，即与样品表 面的立体形貌有关。
第二章 细胞生物学研究方法
§1 细胞形态结构的观察方法 §2 细胞及其组分的分析方法 §3 细胞培养与细胞工程 （§4 细胞及生物大分子的动态变化 §5 模式生物与功能基因组的研究 ）
§1 细胞形态结构的观察方法
• 细胞形态结构的观察——利用各种显微镜技术。
光学显微镜、电子显微镜和扫瞄隧道显微镜的分辨范围
• 是电镜技术、电子衍射技 术与计算机图像处理技术 相互结合的一种技术。
• 原理：用电镜对样品从不 同的倾角拍照，然后用计 算机将系列照片进行处理， 从而展现其三维结构图。
• 用途：研究生物大分子的 三维结构。
二、电子显微镜
• 低温电镜技术：将样品直接冷冻处理，在低温下 使用透射电子显微镜观察样品的显微技术。
• 特点：可通过改变焦点获得细 胞的不同切面——“光学切 片”，然后经过叠加得到细胞 的三维结构。
• 用途：研究细胞内结构及组分 的定性和定位。
• 是现代最先进的细胞生物学研 究仪器之一。
一、光学显微镜
（五）倒置显微镜 • 与普通光镜相反，其光源
与物镜的位置是倒置的。 即光源在上方，物镜在载 物台的下方。 • 特点：工作距离长；影像 是正的。 • 用途：主要用于观察培养 瓶或培养皿中的活细胞； 用于显微操作。
二、电子显微镜
• 显微镜的分辨率与光源有关。
• 由于光镜的可见光波长 （400nm）的原因，使光镜分 辨率无法突破0.2μm这一极限。
• 小于0.2μm的细微结构，即使 再放大倍数也无法看清。这些 细微结构称为亚显微结构或超 微结构。
• 要想看清这些结构就必须提高 显微镜的分辨率。
• 要提高分辨率就得选择波长更 短的光源。
• 取材：0.5mm³； • 固定：戊二醛和锇酸； • 脱水：系列丙酮或乙醇； • 浸透、包埋：环氧树脂； • 切片：用超薄切片机；刀
为玻璃刀（或钻石刀）； 切片捞在金属网上； • 染色：用重金属盐如醋酸 双氧铀和柠檬酸铅染色； • 电镜观察。
二、电子显微镜
（2）超薄切片技术的用途
• 为电镜技术的基础。几乎所有 的细胞超微结构可以用超薄切 片技术在电镜下显示出来。
• 分别用于观察显微结构、亚显微结构和生物大分子结构。
§1 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 （一）普通复式光学显
微镜 • 以可见光作光源。 • 构造与使用 • 评价显微镜优劣的指
标？
一、光学显微镜
• 分辨率：能区分开两个
质点间的最小距离。
D
0.61 N sin
2
λ—光源波长；N —介质折射 率；α—物镜镜口角。
二、特异蛋白抗原的定位与定性
• 根据标记抗体与抗原结合的方式和关系，免疫 标记技术可分为直接法和间接法。
一抗
二抗 一抗
样品
直接法
间接法
• 多应用间接法——敏感性提高；一种标记二抗 可检测多种未知抗原
二、特异蛋白抗原的定位与定性
（一）免疫荧光技术 • 标记物：荧光素 • 检测工具：荧光显微镜 • 特点：抗原抗体反应的特
D
0.61 N sin
2
二、电子显微镜
• 电镜的光源：电子束。 • 其波长为0.01-0.9nm，比
可见光（400nm）波长短 1000倍，所以其理论分辨 本领为0.1-0.2nm，实际分 辨率为5nm。 • 其放大倍数为几万-几十 万倍（106倍）。
D
0.61 N sin
2
二、电子显微镜
s 再用碳在断面上进行垂直喷镀， 形成一连续碳膜；
s 用消化液将样品本身消化掉； s 最终只剩下一层由重金属形成
影像的碳膜——复型膜——反 映了样品断面的自然形态； s 电镜下观察复型膜。
二、电子显微镜
• 用途：观察膜断裂面的蛋 白质颗粒和膜表面结构。
二、电子显微镜
4、电镜三维重构与低温电镜 技术
• 另外，在超薄切片上还可以进 行免疫反应（抗原抗体反应）、 原位杂交、放射自显影、细胞 化学等，从而在亚显微水平上 对生物大分子进行定性、定位 和动态研究。
二、电子显微镜
2、负染色技术 • 原理：在样品上直接滴加染
料如磷钨酸进行染色，吸去 染料、样品干燥后，残余染 料沉积在样品的周围、凹陷、 空隙处，而样品本身反而呈 浅色，故名负染色。 • 特点：简便；分辨率很高， 可达1.5nm。 • 用途：用于观察本身大小即 允许电子束穿透而不经切片 的样品，如病毒、核糖体、 蛋白质纤维等。
• 电镜和光镜的区别： s 光源不同； s 电镜的透镜为电磁透镜
（光镜为玻璃透镜）； s 电镜的镜筒需要真空，因
此电镜的缺陷是不能观察 活的生物样品。 s 电子像是人眼直接看不见 的，因此它是投射到荧光 屏上以便观察，或是用感 光胶片或CCD记录下来； s 由于电镜的光源是电子束， 故其图像和照出来的照片 均是黑白的。