HPLC法测定头孢噻肟钠的有关物质

第53卷第1期 辽 宁 化 工 Vol.53，No. 1 2024年1月 Liaoning Chemical Industry January，2024
HPLC法测定头孢噻肟钠的有关物质
张建廷，张巍
（东北制药集团股份有限公司， 辽宁 沈阳 110027）
摘 要：建立对头孢噻肟钠有关物质的检测方法。

使用安捷伦C18色谱柱，以pH6.2的磷酸氢二
钠缓冲液-乙腈作为流动相。

235 nm的检测波长，30 ℃的柱温，4 ℃的进样室温度，1.0 mL·min-1的流
速，10 μL的进样量。

能够对头孢噻肟钠有关物质进行准确的定性和定量。

测试结果表明，杂质A、杂
质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质7-ACA、杂质J检测限分别为0.007 8、
0.015 1、0.012 6、0.005 3、0.010 8、0.005 4、0.020 1、0.012 9、0.021 4、0.014 0 μg·mL-1，定量限分别
为0.026 6、0.051 4、0.043 0、0.018 8、0.035 9、0.018 0、0.067 4、0.043 1、0.071 5、0.047 2 μg·mL-1，
浓度线性范围0.018 0～16.614 μg·mL-1内线性关系较好，相关系数≥0.999；回收率在90%~108%范围
内。

该方法具有较强专属性、灵敏度高且耐用性好，能够满足检测要求。

关 键 词：HPLC法； 头孢噻肟钠； 有关物质
中图分类号：O657 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2024）01-0170-03
头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，名称为(6R,7R)-3-[(乙酰氧基)甲基]-7-[2-氨基-4-噻唑基-(甲氧亚氨基)乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸钠盐，20世纪70年代由Hoechst（德国）公司和Russel（法国）公司联合研制，作为第3代头孢菌素类抗生素，其临床应用十分广泛[1-3]。

头孢噻肟钠在《中国药典》2020年版、《日本药典》18版、《美国药典》43版及《欧洲药典》10.0版中均有收载[4-7]，且有文献报道注射用头孢噻肟钠有关物质的测定方法及杂质谱研究[8-10]，根据本品的合成工艺路线、参考文献及各国药典，建立了头孢噻肟钠原料药有关物质的测定方法，为质量标准的制定提供指导依据。

1 实验部分
1.1 仪器
安捷伦1260高效液相色谱仪；安捷伦C18色谱柱；AL204型和XPE26型天平（梅特勒托利多）；FE20型酸度计（梅特勒 托利多）。

1.2 试剂
头孢噻肟钠原料药（批号：S442001、S442002、S442003，华北制药华民药业）；头孢噻肟对照品（中国食品药品检定研究院）；杂质对照品（中国食品药品检定研究院、山东致纯医药科技有限公司、广州牌牌生物科技有限公司和石家庄合佳保健品有限公司）；磷酸二氢钾、磷酸和无水磷酸氢二钠（AR，国药集团）；乙腈（HPLC，Fisher）。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用安捷伦C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速为每分钟1.0 mL；30 ℃柱温；235 nm 波长；4 ℃进样室温度；进样10 μL；以pH6.2的磷酸氢二钠缓冲溶液（称取3.6 g无水磷酸氢二钠，加水1 000 mL溶解，用磷酸调pH值至6.2）∶乙腈= 98∶2为流动相A，以pH6.2的磷酸氢二钠缓冲溶液∶乙腈= 40∶60为流动相B，梯度洗脱，见表1。

表1 线性梯度洗脱程序
时间/min流动相A/%流动相B/%
0 100 0
25 80 20
40 60 40
55 0 100
60 0 100
65 100 0
75 100 0
2.2 溶液的配制
2.2.1 空白溶液的配制
稀释剂（取4.6 g无水磷酸氢二钠，3.5 g磷酸氢二钾，加水1 000 mL溶解）。

2.2.2 供试品溶液的配制
第53卷第1期 张建廷，等：HPLC法测定头孢噻肟钠的有关物质 171
精密称取原料药适量，加稀释剂溶解，配制成质量浓度约为1 mg·mL-1的溶液。

2.2.3 对照溶液的配制
精密量取供试品溶液适量，加稀释剂稀释，配制成质量浓度约为0.01 mg·mL-1的溶液。

2.2.4 杂质对照贮备溶液的配制
精密称取杂质7-ACA、杂质J、杂质A~H共10个对照品各 2 mg，配制成质量浓度约为0.2 mg·mL-1的溶液，作为各杂质对照贮备溶液。

2.2.5 杂质定位溶液的配制
精密量取各杂质对照贮备溶液适量，配制成质量浓度约为0.01 mg·mL-1的溶液。

2.2.6 杂质混合对照溶液配制
杂质贮备液1：精密称取5 mg杂质A、杂质C 和2.5 mg的杂质B、杂质D、杂质E和杂质F，置100 mL量瓶中，加稀释剂超声溶解后定容，摇匀。

杂质贮备液2：精密称取5 mg杂质G，2.5 mg 头孢噻肟对照品，杂质H、7-ACA和杂质J各3.75 mg，置500 mL量瓶中，加稀释剂超声溶解后，定容，摇匀。

精密量取杂质贮备液1和2各5 mL，置25 mL 量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，作为杂质混合对照溶液。

2.2.7 系统适用性溶液配制
精密称取头孢噻肟对照品适量，加入杂质对照贮备溶液，配制成头孢噻肟质量浓度为1 mg·mL-1及各杂质质量浓度为0.01 mg·mL-1的混合溶液。

2.3 专属性
取稀释剂、系统适用性溶液、各杂质定位溶液、对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪 10 μL，记录色谱图。

结果空白溶剂不干扰主成分和各杂质检测，各色谱峰间分离度满足要求。

2.4 精密度
2.4.1 仪器精密度
连进5针杂质混合对照溶液，计算杂质峰面积RSD均小于2%，说明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性
取供试品溶液和对照溶液，按“2.1”色谱条件采样分析，有关物质含量按自身对照法计算，RSD均小于30%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.3 中间精密度
为考察随机变动因素对测定结果的影响，由另一分析人员在另一日期，使用不同仪器对样品进行检测，按“2.1”色谱条件采样分析，取平行配制的供试品溶液和对照溶液，各6份，按外标法计算，12份中杂质H、7-ACA、杂质B、杂质J、杂质A、杂质E、杂质C、杂质F、杂质D、杂质G含量的RSD 分别为1.6%、4.5%、8.9%、22.1%、8.0%、9.6%、3.1%、2.1%、2.0%、14.2%，表明方法精密度良好。

2.5 定量限与检测限
采用逐步稀释法测定检测限（S/N≈3）和定量限（S/N≈10），结果表明均能满足各杂质的检测要求，结果见表2。

表2 检测限和定量限结果
名称检测限/（μg·mL-1）定量限/（μg·mL-1）
杂质A 0.007 8 0.026 6
杂质B 0.015 1 0.051 4
杂质C 0.012 6 0.043 0
杂质D 0.005 3 0.018 8
杂质E 0.010 8 0.035 9
杂质F 0.005 4 0.018 0
杂质G 0.020 1 0.067 4
杂质H 0.012 9 0.043 1
7-ACA 0.021 4 0.071 5
杂质J 0.014 0 0.047 2
2.6 线性和范围
分别精密量取按“2.2.5”方法配制的杂质贮备液1和2各2.5 mL，4 mL，5 mL和7.5 mL，置25 mL 量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，即得系列标准线性溶液。

按“2.1”项下色谱条件采样分析，以浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，作有关物质线性回归方程。

结果见表3。

表3 有关物质线性回归方程
名称质量浓度/
（μg·mL 1）
线性方程r 杂质A 0.026 6~15.423 1 A=26 434C+0.301 5 1.000 0
杂质B 0.051 4~16.614 1 A=17 585C-0.174 3 1.000 0
杂质C 0.043 0~16.124 1 A=21 487C+0.031 9 1.000 0
杂质D 0.018 8~15.976 7 A=20 737C-1.212 7 0.999 9
杂质E 0.035 9~14.946 4 A=24 322C+0.729 1 1.000 0
杂质F 0.018 0~13.114 2 A=21 366C+0.126 0 1.000 0
杂质G 0.067 4~3.002 4 A=21 339C-0.796 2 1.000 0
杂质H 0.043 1~2.296 1 A=32 546C+0.544 4 0.999 6
7-ACA 0.071 5~2.406 9 A=11 849C-0.161 5 0.999 9
杂质J 0.047 2~1.660 8 A=18 113C+0.625 1 0.999 7
头孢噻肟0.020 2~1.521 3 A=26 501C+0.237 2 0.999 9 2.7 加样回收率
称取本品约25 mg，精密称定，共10份，分别置25 mL容量瓶中，加入“2.2.5”项下杂质贮备液1
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和杂质贮备液2各4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，各3份，分别加入稀释剂稀释至刻度，摇匀。

取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件分别采样分析，取“2.2.5”项下杂质混合对照溶液同法测定，用外标法计算，结果见表4。

表4 有关物质回收率试验结果
名称 x /% RSD/%
杂质A 101.7 5.0
杂质B 100.9 3.0
杂质C 101.2 4.7
杂质D 101.0 1.5
杂质E 94.9 2.0
杂质F 101.3 1.5
杂质G 102.2 2.4
杂质H 104.1 3.7
7-ACA 105.8 3.4
杂质J 105.0 4.6
2.8 耐用性
供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法制备，分别调整柱温、流速、pH值及不同品牌色谱柱采样分析，考察系统的耐用性。

经测定，理论板数、分离度、杂质个数、杂质含量及总杂在室温30±2 ℃、流速1.0±0.2 mL·min-1、pH 6.2±0.1及使用不同品牌色谱柱时均符合规定，表明该方法耐用性良好。

2.9 溶液稳定性
供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法制备，分别置4 ℃条件下放置，按“2.1”色谱条件分别于0 h、2 h和4 h采样分析，试验表明供试品溶液和对照溶液在4 ℃条件下均不稳定，故需临用新制。

2.10 样品测定
取头孢噻肟钠原料药（批号：S442001、S442002、S442003），供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法配制，按“2.1”色谱条件采样分析，结果3批样品杂质含量均符合要求。

3 结论
目前，头孢噻肟钠在《中国药典》2020年版、《日本药典》18版、《美国药典》43版及《欧洲药典》10.0版中均有收载，结合头孢噻肟钠原料药的合成工艺及降解试验分析其中的潜在杂质[11]，其中杂质B、D、E和F为降解杂质，其余为原料药工艺杂质。

经验证[12-14]，该方法适用于头孢噻肟钠原料药有关物质的检测，能够有效地控制产品质量。

参考文献：
［1］王春玲，中国药典、欧洲药典和美国药典中头孢噻肟钠原料质量控制标准与方法的比较[J].广东化工，2013，40(14)：72-73．［2］朱建平，高燕霞，梁立革，等．关于头孢噻肟钠测定方法的商榷[J].中国药事，2005，19(1)：40-41．
［3］姚蕾，王立新，王红梅，等．229批国产注射用头孢噻肟钠的质量评价[J].药品评价，2012，9(11)：22-27．
［4］中国药典[S]．二部，2020：360-361．
［5］The Japan [S]．18th Edition：684-685．
［6］The United States Pharmacopoeia [S]．43th Edition：V olume I，2020．［7］The European Pharmacopoeia [S]．10.0th Edition：2122-2124．［8］表亚囡，李敏，张锁庆，等．注射用头孢噻肟钠杂质谱研究[J].中国抗生素杂志，2020，45(10)：1027-1033．
［9］赵霞，胡昌琴．HPLC法测定注射用头孢噻肟钠的有关物质[J].中国抗生素杂志，2008，33(12)：746-749．
［10］李婕，陈丽莉，徐子航，等．注射用头孢噻肟钠有关物质测定法中色谱参数转化的探讨[J].药物评价研究，2022，45(7)：
1350-1354．
［11］赵娜，石靖．仿制药一致性评价中杂质研究的常见问题探讨[J].
中国医药工业杂志，2021，52（05）：703-708．
［12］中国药典[S]．二部，2020：480-483．
［13］国家药品监督管理局药品审评中心.化学药物杂质研究的技术指导原则[R]．
［14］国家药品监督管理局药品审评中心.化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则[R]．
Determination of Related Substances of Cefotaxime Sodium by HPLC
ZHANG Jian-ting, ZHANG Wei
(Northeast Pharmaceutical Group Co., Ltd., Shenyang Liaoning 110027, China)
Abstract: A detection method for related substances of cefotaxime sodium was established by using Agilent C18 column with pH=6.2 disodium hydrogen phosphate buffer-acetonitrile as the mobile phase. The detection wavelength was 235 nm, the column temperature was 30 ℃, the inlet room temperature was 4 ℃, the flow rate was 1.0 mL·min-1, and the injection volume was 10 μL. Accurate qualitative and quantitative analysis of cefotaxime sodium related substances was realized. The results showed that the detection limits for impurities A, B, C, D, E, F, G, H, 7-ACA and J were 0.007 8,0.015 1,0.012 6,0.005 3,0.010 8,0.005 4,0.020 1,0.012 9,0.021 4,0.014 0 μg·mL-1, the limits of quantification were 0.026 6,0.051 4,0.043 0,0.018 8,0.035 9,0.018 0,0.067 4, 0.043 1,0.071 5,0.047 2 μg·mL-1, the concentration linear range was 0.018 0~16.614 0 μg·mL-1, and the linear relationship was good, the correlation coefficient was ≥0.999; the average recoveries were within the range of 90%~108%. The method has strong specificity, high sensitivity and good durability, which can meet the inspection requirements.
Key words: HPLC; Cefotaxime sodium; Related substances。