促红细胞生成素抑制TGF-β诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖

促红细胞生成素抑制TGF-β诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖王丽萍;王丽君;王小君
【摘要】目的探讨促红细胞生成素在大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖中的作用.方法培养大鼠CFs.实验分为对照组(control)、TGF-β刺激组(TGF-β终浓度为
5μg/L)和重组人促红细胞生成素(rhEPO,5 000 U/L)干预组:1h后加入TGF-β.24 h 后计数细胞并采用MTT法观察细胞增殖;免疫细胞化学及Western blot法检测α-SMA表达,观察细胞转化;羟脯氨酸定量检测细胞胶原含量;Western blot法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及MMP-2、MMP-9表达.结果与对照组比较,TGF-β使细胞明显增殖(P＜0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成(P＜0.05)、α-SMA表达(P＜0.05)、细胞MMP-2、MMP-9表达增多(P＜0.05).使用重组人促红细胞生成素(rhEPO)干预后,CFs增殖、α-SMA表达及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成较TGF-β组均显著降低(P＜0.05),MMP-2、MMP-9表达进一步增多(P＜0.05).结论生理剂量EPO可抑制TGF-β诱导的大鼠CFs增殖、转化及胶原的合成,促进胶原降解.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2015(035)006
【总页数】5页(P797-801)
【关键词】促红细胞生成素;心肌纤维化;心肌成纤维细胞
【作者】王丽萍;王丽君;王小君
【作者单位】河北联合大学基础医学院生理学系,河北唐山063000;河北联合大学基础医学院唐山市慢性病临床基础研究重点实验室,河北唐山063000;河北联合大学基础医学院生理学系,河北唐山063000;河北联合大学基础医学院唐山市慢性病
临床基础研究重点实验室,河北唐山063000;河北联合大学基础医学院生理学系,河
北唐山063000;河北联合大学基础医学院唐山市慢性病临床基础研究重点实验室,
河北唐山063000
【正文语种】中文
【中图分类】R542.2
心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)是心血管疾病发生发展到一定阶段的重要病理过程，是心室重塑持续发展和难于逆转的主要原因，其发生机制至今仍未明确。

心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖、表型转化、分泌胶原增多及各
型胶原比例失调是MF最主要的变化。

但CFs增殖及迁移的原因及机制还不清楚。

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)主要由肾脏皮、髓质交界处的管周细胞合成，属造血生长因子家族。

EPO通过与跨膜受体(erythropoietin-receptor，EPO-R)结合，调节红系祖细胞的分化、凋亡，刺激幼稚红细胞增生、分化和成熟。

EPO还具有广泛的非造血作用。

大量研究表明，EPO可通过抗细胞凋亡、抗氧化
应激、抗感染和促进血管新生等，对心血管发挥保护作用[1- 2]。

对CFs的研究发现，EPO与依那普利合用可通过降低心肌氧化应激反应而抑制CFs的增殖和血管
疾病的发生[3]。

但EPO在心肌重构中的作用及机制还未见明确报道。

本研究以CFs为研究对象，旨在探讨EPO在心肌重构中的可能作用和机制。

1.1 实验动物和主要试剂
SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，动物合格证号SCXK(京2009- 0008)(河北联合大学实验动物中心)。

重组人促红细胞生成素(rhEPO)注射液(北京四环生物制药股份有限公司)；转化生
长因子-β(TGF-β)和MTT试剂(Sigma公司)；免疫细胞化学试剂盒(碧云天生物试
剂公司)；Western blot 相关试剂(Amresco公司)；兔抗α-SMA、collagen Ⅰ、
collagen Ⅲ、MMP- 2、MMP- 9多克隆抗体(Abcom公司)
1.2 CFs原代培养
常规原代培养大鼠CFs[4]，取第一代细胞用于实验。

1.3 实验分组
将细胞分成3组：1) 对照组； 2) TGF-β组：加入终浓度为5 μg/L的TGF-β；
3)EPO组：终浓度为5 000 U/L EPO预孵育1 h后，加入终浓度为5 μg/L的TGF-β。

1.4 MTT法检测CFs增殖
将对数增殖期CFs均匀接种于96孔培养板中，细胞2×104个/孔。

常规培养24
h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM继续培养24 h后，进行分组加药。

24 h后
每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后吸掉孔内培养液，加入100 μL DMSO，振荡，490 nm波长处测其吸光度A值。

1.5 免疫细胞化学法检测CFs表型转化
爬片细胞用4%多聚甲醛固定60 min后，加入1∶50的H2O2/甲醇，室温孵育
30 min，去除过氧化物酶； 0.5% Triton X-100室温孵育30 min；5% 牛血清白蛋白室温封闭60 min；滴加稀释好的一抗(抗-α平滑肌肌动蛋白，1∶500)，4 ℃过夜。

37 ℃复温30 min，在细胞上滴加二抗(1∶150)，37 ℃孵育30 min；中
性树脂封片，显微镜下观察。

1.6 Western blot法检测CFs中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及MMP- 2、MMP- 9的表达取细胞培养上清液，10% 聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分离蛋白，300 mA转膜2 h
将蛋白转至硝酸纤维素膜。

1% 牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h。

滴加一抗(抗-Ⅰ型胶原、抗-Ⅲ型胶原、抗-基质金属蛋白酶2、抗-基质金属蛋白酶9)，4 ℃过夜；滴
加二抗，室温1 h；化学发光试剂放射自显影。

1.7 统计学分析
采用SPSS16.0统计软件，计量数据以均数±标准差±s)表示，组间比较用单因素
方差分析，两两比较使用Bonferroni检验。

Sigmaplot 10.0软件做统计图。

2.1 EPO对TGF-β介导的大鼠CFs增殖的影响
5 μg/L TGF-β作用24 h能明显刺激CFs增殖(P<0.01)，EPO能明显抑制TGF-β的促增殖作用(P<0.05)(图1)。

2.2 EPO对TGF-β介导的大鼠CFs表型转化的影响
在TGF-β刺激CFs增殖的过程中，myoFb标志物α-SMA表达增强，而EPO干
预使其表达明显回降(P<0.01)(图2)。

2.3 EPO对TGF-β介导的大鼠CFs中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响
TGF-β使CFs培养上清液中胶原含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达增强(P<0.01)，EPO的干预使CFs胶原合成明显减少(P<0.05)(图3)。

2.4 EPO对TGF-β介导的大鼠CFs中MMP- 2、MMP- 9表达的影响
与对照组相比，TGF-β诱导CFs表达MMP- 2、MMP- 9增加(P<0.01)，EPO组MMP- 2、MMP- 9表达较TGF-β组进一步增多(P<0.01)(图4)。

研究结果显示，TGF-β导致大鼠CFs增殖、转化及胶原合成， EPO可使这些变化减轻。

提示EPO可能有抑制MF发生的作用。

已有大量研究证实EPO对心肌的保护作用。

EPO 与EPOR 相互作用可通过MAPK、P13K-AKT以及JAK2-STATS蛋白等途径，抑制心肌凋亡[5-9]。

EPO参与心肌炎性反应。

研究显示， rhEPO可显著减少中性粒细胞浸润，减弱缺血再灌
注诱导的核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP- 1)的活性，减少炎性因子产生，增加抗炎因子生成，降低心肌炎性反应[10]。

EPO还可上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平，促进梗死区周围血管生成，
减少梗死面积[11- 12]。

EPO在心肌重构中的作用受到广泛重视。

研究显示，EPO-R在心肌血管内皮细胞、
CFs和心肌细胞中均有表达。

灌注EPO可使心肌中MAP激酶P42/P44磷酸化，使缺血再灌注后心肌细胞损伤减轻，最大程度恢复左室舒张压和冠脉血流。

在心肌梗死的C57BL/6小鼠，应用EPO干预治疗显著促进了左室的舒张过程，进而使左室射血分数维持稳定[9]。

EPO还可抑制由Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中TGF-
β的生成及胶原的产生[13]。

本研究用TGF-β刺激大鼠CFs增殖后，发现生理剂量EPO可抑制TGF-β诱导的
大鼠CFs增殖，减少myoFb标志物α-SMA的表达，说明其可能参与了抑制MF 的过程。

结果还显示， TGF-β诱导大鼠CFs上Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增多， EPO则
使其表达下降；同时，EPO使TGF-β诱导的大鼠CFs上MMP- 2及MMP- 9表达进一步增加，表明EPO可抑制TGF-β诱导的胶原合成，促进胶原降解。

进一步提示EPO在MF发生发展过程中可能具有重要作用，但其具体机制有待深入研究。

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