细胞实验操作基本流程

细胞实验操作基本流程

（基于明确的细胞试验计划）

1. 实验物品准备

1.1 实验耗材准备

书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。

操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。

1.2 实验试剂准备

书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。

操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。

2. 实验预约

2.1 操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预约本上登记。

2.2 细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。

2.3 细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请。

3. 细胞房环境检查

3.1 清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。3.2 仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。

3.3 台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。

4. 清洁准备

4.1 洗手：肥皂洗——5‰新洁尔灭泡手10秒——70%酒精喷手

4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒子；右侧：试管架、大镊子、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸

5. 实验操作

5.1 基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察

5.2 垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾丢入垃圾筐中

6. 实验善后

6.1 可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程清洗。

6.2 不可回收实验废物处理

6.2.1 酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理

6.2.2 无害废液弃入水槽，大量流水冲洗

6.2.3 固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶

6.3 种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种子细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。

6.4 实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质，按实验废物处理。

6.5 报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏，需要告知负责同学或老师进行维修。

7. 清洁值周和安全检查

7.1 清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需要按要求进行清洁并在值周表上登记及拍照。

7.2 安全检查：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有情况需要及时上报。

注意事项：

1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做

2、实验操作三原则：多看、多问、多想

3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况

细胞操作相关仪器设备使用

恒温干燥箱使用注意事项

注意事项

(一)干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏

物品或引起燃烧。

(二)放入箱内的物品不应过多、过挤。

(三)严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免发生事故。

(四)如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。

(五)放置物品干燥时间不超过24小时。

二氧化碳培养箱使用

箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每2周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗水盆，紫外照射30分钟。

二氧化碳气瓶更换

先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调整分压阀，指针总阀在5分钟左右，分压阀指针在0.15左右。

超净台使用

使用超净台工作15分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操作均应用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。

倒置相差显微镜使用

分为3点：

1.相差装置的调换与安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚

光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。

再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。

2.调焦。打开光源，旋转激光器装盘将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进

光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。

3.合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手

固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出看远

镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。

低速离心机使用

将需要离心的样品对称放入离心机内，关好盖子，接上电源，调整转速和运转时间，按离心键。待转速降至0000后，打开盖子，取出样品。

传递窗使用

每扇门旁设面板一块，面板有一只LED显示灯，一只开门按钮和一只杀菌灯开关。显示灯为绿色时，为开门指示灯，灭表示对面的门卫开状态，禁止此门打开，按开门按钮无法打开门。亮表示允许开门，按开门按钮，门锁打开，开门传递物件。杀菌开关可以控制箱内的杀菌灯的亮和灭。

酸缸、酸筒使用

酸缸分为内缸和外缸，外缸里面放液体，内缸里面放要清洗的器皿，浸泡结束后，将内缸向上提出，内缸上面有很多的小孔，液体从内缸体小孔流出，取出物品，盖上盖子。

移液器使用

一、标准操作

适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。

1)按到第一档，垂直进入液面3-5毫米。

2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少。

3)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。

二、黏稠或易挥发液体的移取

在移取黏稠或易挥发的液体时，很容易导致体积误差较大。为了提高移液准确性，建议采取以下方法：

1)移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出液体时最好多停留几秒。尤其对于移取体积大的液体(如1000~1)，建议将吸头预湿后再移取。

2)采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。

微量移液器使用

使用方法同移液器的使用。

细胞计数板使用

分3点：

将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置