黄芪对细胞毒素相关蛋白A诱导异常增殖的大鼠系膜细胞的影响

黄芪对细胞毒素相关蛋白A诱导异常增殖的大鼠系膜细胞的
影响
陈越;彭莉;郑巧;郝炎;唐志刚
【摘要】目的观察黄芪对细胞毒素相关蛋白A(CagA)诱导异常增殖的大鼠肾小球系膜细胞的影响.方法将体外培养的大鼠系膜细胞随机分为空白对照组、IL-1
β(10ng/ml)阳性对照组、CagA(4μg/ml)实验组、CagA(4Ug/ml)+黄芪(1mg/ml)干预组,给予相应的处理后培养72h,CCK-8法检测4组细胞增殖能力,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平.结果 IL-1β阳性对照组、CagA实验组细胞增殖能力均较空白对照组明显增强(均P＜0.05),PCNA表达水平均较空白对照组明显升高(均P＜0.05);CagA+黄芪干预组细胞增殖能力较CagA实验组减弱(P ＜0.05),PCNA表达水平较CagA实验组降低(P＜0.05).结论黄芪或通过降低PCNA的表达水平,抑制CagA诱导异常增殖大鼠系膜细胞的增殖能力,可为IgA肾病提供新的治疗思路.
【期刊名称】《浙江医学》
【年(卷),期】2018(040)019
【总页数】4页(P2148-2150,2157)
【关键词】黄芪;系膜细胞;IgA肾病;CagA;增殖细胞核抗原
【作者】陈越;彭莉;郑巧;郝炎;唐志刚
【作者单位】643000 四川省自贡市第一人民医院肾内科;643000 四川省自贡市第一人民医院肾内科;643000 四川省自贡市第一人民医院肾内科;643000 四川省自
贡市第一人民医院肾内科;643000 四川省自贡市第一人民医院肾内科
【正文语种】中文
IgA肾病是一组以反复发作性肉眼血尿或镜下血尿为主要临床表现、肾小球系膜区IgA沉积为肾活检主要特征的原发性肾小球疾病[1]。

IgA肾病是我国原发性肾小
球肾炎最常见的类型，约占40%～47.2%[2]，其中发展为终末期肾病的患者可占20%～30%，已成为导致慢性肾功能衰竭最主要的肾小球疾病[3]。

肾小球系膜细
胞异常增殖是IgA肾病发生、发展的重要病理基础[4-5]。

研究发现，细胞毒素相
关蛋白A（CagA）具有促进大鼠肾小球系膜细胞增殖与细胞外基质分泌的作用[6]。

中药制剂黄芪注射液因具有活血化瘀、益气补血的作用，广泛应用于肾病综合征等多种肾脏疾病的治疗，但其作用机制尚未完全清楚[7]。

基于此，本研究通过观察
黄芪对CagA诱导异常增殖的大鼠系膜细胞的影响，探讨其抑制系膜细胞增殖的
作用机制，以期为IgA肾病的防治研究提供参考，现报道如下。

1 材料和方法
1.1 材料大鼠系膜细胞株（HBZY-1）由西南医科大学中心实验室惠赠；IL-1β试
剂为美国R&D公司产品；幽门螺杆菌（Hp）CagA购自上海合星生物科技有限
公司；1640培养基为美国Gibco公司产品；黄芪注射液由成都地奥九鸿制药厂生产，每安瓿2ml，2g/ml，批号0306052；FBS购自美国Gibco公司；SABC免
疫组化染色试剂盒为北京中杉金桥公司产品，批号AP9023；CCK-8试剂盒为北
京赛驰生物科技有限公司产品。

1.2 方法
1.2.1 大鼠系膜细胞培养把复苏好的系膜细胞放入由1640培养基加入灭活FBS （56℃灭活）配置好的细胞培养基中，并在培养基中加入链霉素、青霉素，终浓度分别为0.1mg/ml和100U/ml。

把培养瓶置于5%二氧化碳、37℃孵箱内，使用倒置相差显微镜观察细胞生长，选择3至6代的系膜细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组大鼠系膜细胞接种并充分洗涤后，根据不同的干预方法分为4组：（1）空白对照组；（2）IL-1β（10ng/ml）阳性对照组（IL-1β 浓度参考文献[8]）；（3）CagA（4μg/ml）实验组（CagA 浓度参考文献[5]）；（4）CagA+黄芪干预组:加入4μg/ml的CagA和1mg/ml的黄芪注射液（黄芪浓度参考文献[6]）。

1.2.3 细胞增殖能力检测采用CCK-8法。

系膜细胞培养生长至70%融合，胰酶消化后稀释调整细胞浓度为103/ml，接种于96孔板200μl/孔（板的四周孔加入200μl无菌PBS液以保湿），37℃、5%二氧化碳环境培养6～8h，待系膜细胞贴壁后，换用冷冻不含血清的1640培养基培养24h使系膜细胞同步化，均处于静止期。

而后按上述分组方法换用含有血清的培养基，4孔/每组。

在培养箱中孵育72h后，加入CCK-8试剂20μl/孔，孵育4h，37℃上下左右的混合震荡培养板15min，上酶标仪检测450nm的OD值，OD值越大代表细胞增殖能力越强。

实验重复4次，取平均值。

1.2.4 增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平检测采用免疫组化染色法。

大鼠系膜细胞生长至80%融合后，消化重悬细胞，将细胞悬液接种于6孔板内圆形爬片（事先泡酸、消毒、烘干后备用，并于实验前用鼠尾胶原Ⅰ处理圆形爬片）上，每个圆形爬片200μl，37℃、5%二氧化碳孵育30min，大部分细胞贴壁后，轻轻补加培养液至2ml，继续培养24h后，换无血清的培养液培养24h使其生长同步化。

按上述分组方法处理细胞，4孔/每组，待72h后取出爬片，按SABC免疫组化染色试剂盒操作步骤检测PCNA的表达。

用PBS液代替一抗作为对照（呈阴性），使
用Image-Pro Plus6.0的软件对染色结果进行分析，运用光密度分析及免疫组化图像测量平均光密度值（IOD值），IOD值=累计光密度值/细胞数目。

IOD值越大代表PCNA表达水平越高。

1.3 观察指标观察并比较4组大鼠系膜细胞增殖能力与PCNA表达水平。

1.4 统计学处理应用SPSS 13.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 4组大鼠系膜细胞增殖能力比较见表1。

表1 4组大鼠系膜细胞增殖能力比较（IOD值）组别CagA+黄芪干预组CagA实验组IL-1β阳性对照组空白对照组n 4 4 4 4细胞增殖能力1.1652±0.1195
1.4420±0.0792 1.8179±0.085 0.6296±0.1252
由表1可见，4组大鼠系膜细胞增殖能力比较差异有统计学意义（P＜0.05），IL-1β 阳性对照组、CagA 实验组细胞增殖能力均较空白对照组明显增强（均P＜0.05），CagA+黄芪干预组细胞增殖能力较CagA实验组减弱（P＜0.05）。

这一结果提示黄芪对CagA诱导异常增殖的大鼠系膜细胞有明显抑制作用。

2.2 4组大鼠系膜细胞PCNA表达水平比较见图1、表2。

图1 4组大鼠系膜细胞PCNA表达免疫组化染色所见（×200）
表2 4组大鼠系膜细胞PCNA表达水平比较组别CagA+黄芪干预组CagA实验组IL-1β阳性对照组空白对照组n 4 4 4 4 PCNA表达水平0.2267±0.0124
0.3827±0.0115 0.4410±0.0094 0.1902±0.0135
由图1、表2可见，4组大鼠系膜细胞PCNA表达水平比较差异有统计学意义（P ＜0.05），IL-1β阳性对照组、CagA实验组系膜细胞PCNA表达水平均较空白对照组明显升高（均P＜0.05），CagA+黄芪干预组系膜细胞PCNA表达水平较CagA实验组降低（P＜0.05）。

即对于CagA诱导异常增殖后的大鼠系膜细胞，
黄芪干预可明显降低细胞PCNA表达水平。

3 讨论
IgA肾病是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，也是导致终末期肾衰竭的主要原因之一，其病理特征是以包括IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区沉积为
主要表现，其中沉积的IgA主要以二聚体或多聚体的形式存在[9]。

而正常情况下，IgA二聚体全部由黏膜组织产生，从而提示肾脏沉积的IgA可能是肾外黏膜组织
受抗原刺激后产生的IgA分子在“错误”的地点和“错误”的时间出现，进而沉
积在肾小球系膜区，启动了IgA肾病的发生与发展。

有研究指出，黏膜免疫功能
紊乱引起糖基化相关酶类如β-1，3半乳糖基转移酶及其分子伴侣Cosmc的表达
和（或）活性异常，使黏膜淋巴组织B细胞产生的IgA分子O-糖链糖基化异常，是导致IgA肾病发生、发展的主要机制[10]。

因此，有学者认为IgA肾病发病机
制研究的方向应以扁桃体等黏膜组织免疫功能紊乱为主[11]。

而扁桃体切除术的确能使部分IgA肾病患者的生活质量有所提高，尿检异常有所改善、肾功能保持相
对稳定，这进一步提示扁桃体可能是IgA肾病的致病抗原所在场所之一[12-13]。

Hp是一种革兰阴性微需氧菌，CagA是其主要的效应蛋白之一。

CagA破坏胃上
皮细胞，导致黏膜损伤、组织炎症甚至诱导肿瘤发生，在消化性溃疡等胃肠道疾病、Hp感染方面起关键的致病作用。

此外，有报道称Hp在肾小球系膜区弥漫性、球形分布，证明Hp感染与IgA肾病的发病有关[14]。

Hp可能是IgA肾病的重要致病抗原。

CagA作为Hp主要的效应蛋白之一，具有促进肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的作用[15]。

既往研究发现，IL-1β在体外试验中亦可促进系膜的增
殖和细胞外基质分泌[16]，因此IL-1β作为本实验的阳性对照。

具有益气补肾、活血化瘀作用的中药制剂黄芪注射液现在临床广泛应用于多种肾脏疾病的治疗，有提高血浆白蛋白、减轻肾损害的作用，但其作用机制尚不明确[17]。

本研究结果显示，对于CagA诱导异常增殖后的大鼠系膜细胞，黄芪干预可明显
抑制细胞增殖。

PCNA在细胞周期G1晚期表达开始增加，在S期达到高峰，其表达可反应细胞增殖的程度。

本研究结果显示，对于CagA诱导异常增殖后的大鼠系膜细胞，黄芪干预可明显降低细胞PCNA表达水平。

综上所述，IgA肾病是一种多病因引起的以肾小球系膜区IgA沉积为主的系膜增生性肾小球肾炎，系膜细胞异常增殖与IgA肾病的发生、发展密切相关。

本研究结果显示，作为一种经典的中药，黄芪或通过降低PCNA的表达水平，抑制CagA诱导异常增殖的大鼠系数细胞增殖能力，可为IgA肾病提供新的治疗思路。

4 参考文献
【相关文献】
[1] Kang JY,Ho KY,Yeoh KG,et al.Peptic ulcer and gastritis in uraemia,with particular reference to the effect of Helicobacter pyloriinfection[J].J
GastroenterolHepatol,1999,14(8):771-778.
[2] Tseng GY,Lin HJ,Fang CT,et al.Recurrence of peptic ulcer in uraemic and non-uraemic patients after Helicobacte pylori eradication:a 2-year study[J].Aliment Pharmacol
Ther,2007,26(6):925-933.
[3] Huang JJ,Huang CJ,Ruaan MK,et al.Diagnostic efficacy of(13)C-urea breath test for Helicobacter pylori infection in hemodialysis patients[J].Am J Kidney Dis,2000,36(1):124-129.
[4] Moriyama T,Kaneko T,Fuji Y,et al.High prevalence of Helicobacter pylori in fection in Japanese patients with membranous nephropathy[J].Aliment Pharmacol
Thersuppl,2006,2(1):189-193.
[5] Sugimoto T,Furukawa T,Maeda T,et al.Marked reduction of proteinuria after eradication of gastric Helicobacter pylori infection in a patient with membranous nephropathy:coincidental or associated[J].Inten Med,2007,46(17):1483-1484.
[6] Wang L,Tan RZ,Chen Y,et al.cagA promotes proliferation and secretion of extracellular matrix by inhibiting signaling pathway of apoptosis in rat glomerular mesangial
cells[J].Ren Fail,2016,38(3):458-464.
[7] Gong SF,Feng X,Wang FF.Treatment of Astragalus Membranaceus and Prednisone in
90 Primary nephritic syndrome patients[J].Suzhou Univ J Mde Sci,2007,27(5):772-774(In Chinese).
[8] 赵景宏,王军平,曾毅,等.IL-1对肾小球系膜细胞增殖和周期素依赖激酶2表达的影响[J].第三军医大学学报,2000,7(22):676-678.
[9]Yu HH,Chu KH,Yang YH,et al.Genetics and immunopathogenesis ofIgAnephropathy[J].ClinicalReviews in Allergy&Immunology,2011,41(2):198-213. [10] Barratt J,Eitner F,Feehally J,et al.Immune complex formation in IgAnephropathy:a case of the'right'antibodies in the'wrong'place at
the'wrong'time?[J].Nephrology,dialysis,transplantation:official publication of the European Dialysis and Transplant Association-European RenalAssociation,2009,24(12):3620. [11] Coppo R.Can a dysregulated mucosal immune system in IgA nephropathy be controlled by tonsillectomy?[J].Nephrology,dialysis,transplantation:official publication of the European Dialysis and Transplant Association-European Renal
Association,2010,25(8):2395.
[12] Xie Y,Chen X,Nishi S,et al.Relationship between tonsils and IgA nephropathy as well as indications of tonsillectomy[J].Kidney International,2004,65(4):1135-1144.
[13] Mariotti A,Agrawal RA.The role of tonsillectomy in pediatric IgA
nephropathy[J].Archives of Otolaryngology-Head&Neck Surgery,2009,135(1):85-87. [14] Barratt J,Bailey EM,Buck KS,et al.Exaggerated systemic antibody response to mucosal Helicobacter pylori infection in IgA nephropathy[J].Am J Kidney Dis,1999,33(6):1049-1057.
[15] 肖建武,易著文,吴小川,等.黄芪对大鼠肾小球系膜细胞增生水平的影响[J].浙江中西医结合杂志,2003,13(3):145-146.
[16] Wang R,Wan Q,Zhang Y,et al.Emodin suppresses interleukin-1β induced mesangial cells proliferation and extracellular matrix production via inhibiting P38 MAPK[J].Life Sciences,2007,80(26):2481.
[17]Gong SF,Feng X,Wang FF.Treatment of Astragalus Membrane and prednisone in 90 primary nephrotic Syndrome patients[J].Univ J Med Sci,2007,27(5),772-774.。