EMSA 操作手册

EMSA 操作流程
寡核苷酸标记：
1．将序列互补的寡核苷酸片断在TEN-buffer（10mM Tris, 1mM EDTA, 0.1M Nacl, pH8.0）中按摩尔比1：1混合。

2．95℃10min使核苷酸片断充分解离。

3．将样品缓慢冷却至15-25℃。

4．用灭过菌的TEN-buffer将核酸稀释至3-4pmol/ul
5．取3.85pmol 或100ng 稀释好的核苷酸加入小炮弹管中，并加入ddH2O 使终体积达到10ul。

（对照管中加入1ul对照寡核苷酸（管6）和9ul的ddH2O）。

6．将以上小管放在冰上并依次加入以下试剂：
4ul 5×Labeling buffer（管1）
4ul CoCl2-solution （管2）
1ul DIG-ddUTP solution （管3）
1ul 末端转移酶（400U）（管4）
7．小心的将以上溶液混匀并迅速进行离心。

8．在37℃反应15min，之后置于冰上。

9．加入2ul 0.2 M EDTA (pH8.0)终止反应。

10．再加入3ul ddH2O，使终体积达到25ul，标记好的寡核苷酸浓度达到4ng/ul 或
0.155pmol/ul。

标记效率测定：
11．试剂准备：见样品检测部分的试剂准备。

12．按下表制备系列稀释的制备标记寡核苷酸和对照组标记寡核苷酸。

13．各取对照组和制备组1-5号管中标记的寡核苷酸1ul 点在尼龙膜上
14．紫外灯下交联5min 或120℃烤30min 使标记的寡核苷酸固定在膜上。

15．15-25℃在Washing buffer 中漂洗膜2min。

16．在10ml Blocking solution 中孵育30min。

17．在20ml Anitybody solution 中孵育30min。

18．用10ml Washing buffer 漂洗两次，每次15min。

19．在10ml Detection buffer 中平衡2-5min。

20．将膜转有DNA的一面向上平放于塑料膜上，在上面均匀加上0.1ml CSPD working solution。

21．立即将塑料膜折起，盖在尼龙膜上，避免气泡产生，使CSPD 能均匀分布于膜表
面，15-25℃孵育5min。

22．挤出多余的液体，将塑料膜沿尼龙膜边封好，在37℃再孵育10min。

23．15-25℃用X胶片曝光15-25min。

通过与对照组DIG-标记的DNA（管7）曝光情况对比就可以确定标记的效率。

样品检测：
24．配制浓度为6－8％含0.5×TBE的非变性聚丙烯酰胺凝胶。

（配方：3.6ml H2O;
1.2ml 丙稀酰胺；600ul 甘油；600ul TBE；AP 42ul；TEMED
2.1ul）
25．将用DIG标记的寡核苷酸链用水稀释到15－30fmol/ul.
26．将标记的对照组寡核苷酸链用水稀释到15.5fmol/ul.
29．将配好的反应体系混合均匀，在15－25℃温育15min。

30．将反应体系转移至冰上并在每管中加入5ul无溴酚蓝的Loading buffer （12号瓶）并迅速上样电泳。

[电泳缓冲液：0.5×TBE(Tris-borate-EDTA buffer, 10×：890 mM Tris，890 mM boric acid, 20 mM EDTA, pH 8.0)]
注意：电泳时不能使胶过热，应在4℃中进行。

电泳恒压40V，5h (根据DNA片断大小进行调整)。

31．小心的分开两块胶板，将一块同胶等大的尼龙膜在转膜buffer （0.5×TBE）中平衡5min后贴在膜上，赶尽胶与膜之间的气泡。

32．将4层与胶等大的滤纸在转膜buffer中平衡后铺于尼龙膜上，用玻璃棒赶出滤纸和膜之间的气泡。

33．将剩下的一块玻璃板和胶分离，再在胶暴露的一面贴上4层平衡好的滤纸。

置整个体系于转膜设备中，在恒压30V的条件下转膜60min。

34．转膜结束后，将膜取出，在80℃烘烤5min。

35．把膜贴在一层用2×SSC（0.03M柠檬酸钠,0.3M Nac1）浸透的滤纸上（转有DNA 的一面向上），在紫外灯下交联5min。

36．试剂准备：
Washing buffer ：0.1 M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(V/V) Tween 20 Maleic acid buffer : 0.1 M Maleic acid, 0.15M Nacl; adjust with NaOH (solid) to pH 7.5(20℃) Detection buffer : 0.1M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (20℃)
Blocking stock solution（10×）:在65℃加热器或微波炉、高压锅中用马来酸溶解Blocking reagent 固体（瓶12）至10％（w/v）. 最终的溶液应该是浑浊的。

（溶液在2-8℃无菌状态下可以保存4星期，分装的溶液应保存在-15至-25℃。

）
1×Blocking solution ：将10×溶液用马来酸1：10稀释即可得。

（现配现用）
Antibody solution ：Anti-Digoxigenin-AP储液每次在用之前必须进行10000rpm×5min离心，再从液面处取所需量用Blocking solution 进行1: 10000（75mU/ml）稀释。

（该液可以在2-8℃保存12h）
CSPD working solution :将0.1mg/ml的储液用Detection buffer 进行1：100稀释。

（2-8℃避光保存）
以下步骤均在15-25℃进行
37．在Washing buffer 中漂洗膜1-5min。

38．在适量Blocking solution 中孵育60min（可4℃过夜）。

39．在约10ml Anitybody solution 中孵育60min（可4℃过夜）。

40．用10ml 左右Washing buffer 漂洗两次，每次15min。

41．在10ml 左右Detection buffer 中平衡2-5min。

42．将膜转有DNA的一面向上平放于保鲜膜上，在上面均匀加上300ul CSPD working solution（管15 为100×液，用Detection buffer 稀释到1×使用。

）。

43．立即将保鲜膜折起，盖在尼龙膜上，避免气泡产生，使CSPD 能均匀分布于膜表面，15-25℃孵育5min。

44．挤出多余的液体，用保鲜膜将尼龙膜包好，在37℃再孵育10min。

45．15-25℃用X胶片曝光2h。

注意：尼龙膜上的荧光可以保持至少48小时。

在反应开始的前几个小时中荧光信号会逐渐变强，接着会到达一个平台期并持续24-48小时。

因此，为达到理想的曝光效果，可以进行多次曝光。