《细胞工程》第4章动物细胞培养工程4

美国，产业 化规模生产 蛋白质公司
中国 批式培养 （batch） 流加培养 （fed batch） 2-100L 中试规模 5-500L 中试规模 5-30L 中试规模
美国 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器
灌注培养 （perfusion）
● 防止细胞机械破裂的培养液成分——
4．4 动物细胞培养工艺
●动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； ● 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同； ●动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。
D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；（10000L规模、g/L级）
E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决： 去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用
4．2 生产用动物细胞系
4．2．1 生产用动物细胞发展： 生产用动物细胞——是指按生产条件 选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生 物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍 体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的 历史演化。
4．3 培养液 与培养 环境
4． 3 ． 1 动物细胞 培养条件
4．3．2 动物细胞培养液和添加剂
4．3．3 无血清无蛋白培养
优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程； 缺点：比较贵，针对性强。
4．3．4 动物细胞培养用生物反应器
4．3．5 培养环境与生物反应器
4．4．1 动物细胞培养工艺基础
实验室规模（laboratory scale） A 、工艺实验研修阶段 中试规模（pilot scale） 生产规模（production scale） 实验室设施 B、实验室管理 ——选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规） D、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装 无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒
C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）
中国，实验室规模 流加工艺：产量高易放大、操作简单， 如Genentech、IDEC、 MedImmune、 Merk公司， 连续灌注工艺：适合不稳定产品、 培养利用低、操作复杂、 产品回收大，如：Genzyme、 Genetic Institute、 Bayer公司
4．3．3 动物细胞培养的操作方式
4．4．4 培养过程的监测与控制
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4．4．5 动物细胞培养工艺
4．4．6 工艺的选择与设计
（反应器投入占整个部分50%）
B
、 生 产 工 艺 的 设 计 原 则
4．4．7 杂交瘤细胞大规模培养制备 抗体的工艺
A、工艺流程图
——肝癌单抗片段Hab18F（ab/）2体外制备工艺
通气搅拌 生物反应器
传质系数（KL）——氧传质系数仍与扩散 系数的2/3次方成正比，但流体主体 的湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献
气液传质比表面积（A）——气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气 量有关
强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化）
● 决定动物细胞剪切敏感性的因素： 不同细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切 敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞； 细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力； 细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。 ● 微载体细胞培养系统中的细胞损伤——微载体湍流涡旋 相互作用是主要因素； ● 悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤——鼓泡式、气升 式相对温和，决定于气泡聚并与破裂速率；
●用重组技术或细胞融合技术建立的工程 细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度 培养时，都需经过一定时间的细胞适应能 力驯化； ●细胞对无血清培养条件的适应能力和生 长形式的驯化，对于建立优化的无血清高 密度培养工艺非常重要；
●通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群 体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能 特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基 因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；
●悬浮培养 的驯化 主要包括
无血清培养条件的驯化 高细胞密度培养的驯化 （时间、难度不一） 贴壁生长转化为悬浮生长的驯化
B、贴壁培养 （anchorage-dependent culture）
——是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养 方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如 CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较 长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培 养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。 ● 优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高， 产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高；
B、主要设备
1L悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞 （磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续 旋转过滤器，其它全控） 5L细胞发酵罐（德国，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养 30L细胞发酵罐BiostatRC20（德国，BraunBiotech） （冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大
● 敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨 酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产 生，以改变细胞能量代谢途径； ● 引入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、 胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性； ● 构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对 恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）
● 将细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制蛋 白基因p21和p27引入细胞，获得细胞周 期增殖控制的表型，通过调控细胞增殖 周期达到调控细胞增殖目的；（参见下 图） ● 导入外源性糖基转移酶基因，改变细 胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基 化修饰。
B、代谢工程（metabolic engineering）：
是通过DNA重组技术和分子生物学手 段改变酶系功能或物质转动功能，以改 进细胞某些方面的代谢活性，进行精确 目标的遗传操作。
C、具体优化改选措施： ● 构建在无血清、无蛋白条件下增殖的细 胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清 是基本添加物，但含未确定成分，如有 毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易 污染）
bu
4．2．5 生产用动物细胞代谢工程优化改造 A、原因：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细 胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近 天然构想，其生物自身的生长代谢特性并非 最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产 率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法 优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性 进行功利性修饰。
A、悬浮培养 （suspension culture）：
——是指细胞自由地悬浮于培养液内生长 增殖的一种培养方法；适用于悬浮培养的 生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0， NSO），不适用于正常细胞培养。此种方 法操作简便，传质比较好，易放大，条 件均一；但需产物截流。1996-2000年， 美国，FDA批准70%重组治疗药物。
A、原因 ● 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环 境的控制，而生物反应器提供的培养环境 能否满足需要，直接与反应器的型式、操 作状态有关； ● 为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均 一的培养环境，必须使反应器的保持一定 的混合水平和通气条件；
● 动物细胞较大、无壁，它对流体作 用力敏感（剪切敏感性），易损，所 以，反应器的设计、放大和操作过程 必须解决供氧混合与细胞损伤间的矛 盾； ● 必须了解生物反应器的传质与混合 特性、培养环境液体力学现象对动物 细胞生长、代谢及细胞操作的影响；
4．1．2 发展历程：
4．1．3 动物细胞培养的特点与方法：
A、动物细胞培养的主要特点 动物细胞对营养要求高 ——血清来源受限，质量不稳，研发无 血清培养液； 动物细胞对培养环境适应性差 —— 生长慢，时间长，生长用动物细胞 需驯化；
动物细胞培养对环境条件要求严格 ——pH，混合气体（O2、CO2、N2）； 动物细胞培养过程易产生污染 —— 要求苛刻； 各种细胞素长期培养易变异 ——需监测其形态、生长、表达过程； 绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生 长特征——需载体。
4．2．2 生产用动物细胞的来源
4．2．3 常用生产用动物细胞的特性（参见下表）
4．2．4 生产用动物细胞库 生产用动物细胞库:是指为保证生产用动
物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性， 能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量 生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三 级细库系统相应保存管理措施（档案和技术 标准）。
●生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响：
传质系数（KL）——受氧在培养液中的扩散速度影响， 气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系， 鼓泡式 小气泡（<2.5mm）传质系数与扩散系数的 反应器 2/3次方成正比， 大气泡（>2.5mm）传质系数与扩散系数的 1/2次方成正比。 传质比表面积（A）——与通气量成正比，而与气泡直径 的三次方成反比，如增加气量、 减少气泡直径，会提高细胞死亡率 实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对 传质要求的前提下，减少细胞破损。
B、动物细胞培养工程的方法
悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐 ——适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等
方 法
单层培养 ——滚瓶法：间歇接触培养液和空气 固定化培养 微珠 微载体培养 比表面积大 中空纤维
4．1．4 动物细胞培养工程技术现状与展望
A、70%生物技术产品使用动物细胞生产； B、生产技术、工艺条件改变明显： 培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变 为悬浮连续式； 培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液； 生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。
B、具体关系：
● 动物细胞对培养环境传质和混合的要求 对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环 境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要 因素是细胞生长对氧的要求； 反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2· C，其中， min）≥qO2· KL——液体一侧氧传质系数，A——气液比表面积， qO2——单位细胞耗速率，C——细胞密度， C*O2——液体中氧的饱和浓度，CO2· min——液体中最低氧浓度。 一般而言， 提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾 胞操作速率
生 物 反 应 器
生 物 反 应 器 的 操 作
Cell Engineering
细 胞 工 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
4．4．2 动物细胞培养方法
原代细胞 ●依细胞来源，可分 传代细胞培养 液体培养 ●依培养液种类不同，可分 固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养 ●依反应器类型和操 中空纤维培养 作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养 ●依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）
4．1 概述
4．1．1 定义：
动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动 物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生 物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特 性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三 部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术 （过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规 模生产基因工程药物，单抗和疫苗等生物工程产品的 关键技术。