双环醇对药物性肝损伤的保护作用及机制研究

双环醇对药物性肝损伤的保护作用及机制研究Ⅰ双环醇对药物性肝损伤的保护作用及机制研究药物性肝损伤(drug induced liver injury, DILI)是指药物在使用过程中,因药物本身或其代谢产物导致的肝脏损伤,亦称药物性肝病。

近年来随着新药的不断上市及临床药物联合应用的需求,药物性肝损伤的发病率呈逐年增加的趋势。

据文献报道,目前临床约40%的肝炎和25%的急性肝衰竭由药物引起,而DILI 约占药物不良反应的10%-15%。

DILI的发生、发展是涉及遗传、药物种类等多因素过程,其发病机制与氧化应激、细胞因子释放、线粒体损伤、肝细胞凋亡等密切相关。

目前,停药和同时给予肝保护药物是临床治疗DILI的主要手段。

双环醇(bicyclol)是我所研制的治疗慢性肝炎的国家一类新药。

临床资料显示,双环醇可明显改善慢性乙肝病人的临床症状和损伤的肝功能,且停药后反跳率低,长期应用未发现明显不良反应。

以往药理研究表明,双环醇对多种化学毒物、酒精等引起的实验性急慢性肝损伤均具有较好的肝保护作用,其作用机制与其清除自由基、保护线粒体功能、抑制炎症因子过表达、抑制损伤因素导致的细胞凋亡等密切相关。

近期临床资料表明,双环醇已用于抗精神病药、抗肿瘤药和抗结核药诱发DILI的治疗,明显改善患者受损的肝功能,但双环醇对DILI保护作用相关机制尚不明了。

本研究选用抗结核药{利福平(rifampicin, RIF)、异烟肼(isoniazid, INH)和PZA (pyrazinamide, PZA))和阿托伐他汀引起的两种DILI模型观察双环醇的保护作用,并对相关机制进行深入探讨,为其临床应用提供科学可靠的实验依据。

1.双环醇对抗结核药引起大鼠肝损伤的保护作用及机制研究大鼠灌胃给予抗结核药(RIF:200mg/kg; INH:50mg/kg; PZA:100mg/kg)30天可出现明显肝损伤,表现为血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT).天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST).碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)和总胆红素(total bilirubin, TBIL)水平升高以及肝细胞浊肿、炎细胞侵润、肝细胞坏死等病理变化。

双环醇给药(50.100.200mg/kg)可剂量依赖性显著抑制抗结核药引起的血清ALT、AST、AKP和TBIL升高,上述肝组织病理变化也得到明显改善。

氧化应激是抗结核药肝损伤的主要诱因之一。

大鼠灌胃给予抗结核药30天后,肝脏脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)显著升高,为正常对照组的2.28倍。

而非酶抗氧化物谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量显著下降,为正常对照组的32.42%。

双环醇(50、100、200 mg/kg)可显著抑制肝脏MDA水平的升高,并防止GSH耗竭,使其维持在正常水平。

此外,肝脏抗氧化物酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD),过氧化氢酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,
GSH-px)活性也发生显著变化,与对照组相比分别降低51.92%、53.46%和28.89%。

双环醇给药(200 mg/kg)可显著抑制SOD、CAT和GSH-px活性的降低,增强机体的抗氧化能力。

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α、TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是介入肝损伤的重要炎症因子。

抗结核药肝损伤大鼠肝脏IL-1p和TNF-α水平明显升高,分别为正常对照组的1.72和1.99倍。

双环醇(100、200 mg/kg)给药可明显抑制肝脏中IL-1β和TNF-α水平的升高。

此外,双环醇对肝损伤大鼠血清TNF-α和IL-1p的异常升高也有明显抑制作用线粒体损伤尤其是线粒体呼吸链(mitochondrial respiratory chain, MRC)功能异常在肝损伤发病过程中发挥关键作用。

大鼠灌胃给予抗结核药30天后,肝脏MRCⅠ和Ⅳ活性与对照组相比分别降低38.6%和63.40%。

双环醇给药(200 mg/kg)可显著增加MRCⅠ和MRC Ⅳ活性,使之恢复到正常水平。

抗结核药肝损伤大鼠肝脏线粒体还出现对罗丹明123(rhodamine 123,R123)的摄取量明显少于正常对照组,对高钙浓度诱发肿胀的敏感性显著降低,提示线粒体发生了膜渗透性转换。

双环醇给药(200 mg/kg)可显著改善受损的线粒体功能。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是机体抵御肝脏应激损伤的第一道防线,大鼠口服抗结核药后肝脏HGF蛋白表达明显上调,为正常对照组动物的1.4倍。

双环醇给药(200 mg/kg)可进一步促进该蛋白的表达,为正常对照组动物的1.89倍。

CYP2E1是体内参与INH代谢的细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450s),代谢过程中产生的氧自由基被证实与INH引起大鼠和人肝损伤密切相关。

此外,CYP2E1可被酒精和某些药物如RIF诱导。

体外肝微粒体温孵和体内动力学研究表明,给予抗结核药30天后,大鼠肝脏CYP2E1活性和蛋白表达均明显增加。

同时给予双环醇(200 mg/kg)后CYP2E1活性较模型组相比降低30.83%,并可一定程度地抑制蛋白表达水平的异常升高。

体内动力学实验表明,大鼠灌胃给予抗结核药30天后,血浆INH的AUCo-t
和Cmax与正常组大鼠相比略微下降,双环醇(200 mg/kg)给药可抑制INHAUCo-t 和Cmax的降低。

而双环醇给药对RIF.PZA和吡嗪酸的血浆药代动力学未见明显影响。

此外,双环醇对三种抗结核药体外代谢影响的研究结果表明：1)双环醇低浓度(25 gM)对RIF、INH在大鼠肝微粒体中的代谢均未见明显抑制作用,中、高浓度双环醇(50、100μM)对RIF和INH的体外代谢有不同程度的抑制作用,但该浓度明显高于药效剂量的Cmax。

2)双环醇(25、50、100μM)对PZA在大鼠肝胞浆中的体外代谢无明显影响。

3)双环醇(1.5、5、10 pM)对RIF、PZA在人肝微粒体中的体外代谢均无明显影响。

上述结果提示,双环醇对RIF、INH和PZA的体外代谢影响较小。

综上所述,双环醇对抗结核药引起的大鼠肝损伤具有显著的保护作用,其肝保护机制可能与减轻氧化应激、抑制细胞因子表达、改善线粒体功能、促进HGF 的表达和调控CYP2E1相关。

此外,双环醇在发挥保肝作用同时,对抗结核药的体外代谢及大鼠体内血浆动力学影响较小。

2.双环醇对阿托伐他汀引起高脂饮食金黄地鼠肝损伤的保护作用高脂饮食金黄地鼠每日灌胃给予阿托伐他汀(12 mg/kg)连续9天可出现明显肝损伤,表现为血清生化指标(ALT、AST和TBIL)升高以及肝组织形态学改变(肝小叶结构明显紊乱、肝束排列不齐、肝窦明显狭窄、弥漫性炎性细胞浸润、灶性坏死、大片状出血坏死)。

双环醇(50、100、200mg/kg)预防或治疗给药可剂量依赖性显著抑制阿托伐他汀引起的血清ALT、AST、AKP和TBIL升高,上述肝组织病理变化也得到明显改善。

阿托伐他汀引起高脂饮食／肝损伤金黄地鼠还可见肝脏MDA显著升高,为正
常对照组的1.47倍,而肝脏抗氧化物GSH含量明显降低,为高脂饮食对照组的44.03%。

双环醇(50、100.200 mg/kg)预防及治疗给药可显著抑制肝脏MDA水平的升高,并防止GSH耗竭,使其维持在正常水平。

此外,肝脏SOD、CAT和GSH-px活性也发生显著变化,与高脂饮食对照组相比,分别降低42.53%、39.03%和35.04%。

双环醇(200 mg/kg)预防及治疗给药可显著抑制SOD、CAT和GSH-px活性的降低,增强机体的抗氧化能力。

本研究中高脂饮食对照组动物肝脏MDA、GSH水平及SOD、CAT和GSH-px活性与标准饮食对照组相比未见明显变化。

阿托伐他汀可引起高脂饮食／肝损伤金黄地鼠肝脏IL-1β和TNF-α水平明显升高,分别为高脂饮食对照组的8.64和4.04倍。

双环醇(50、100、200mg/kg)预防或治疗给药可明显抑制阿托伐他汀引起的肝脏TNF-α和IL-1β水平升高,并具有一定的剂量关系。

此外,双环醇对血清TNF-α和IL-1β的异常升高也有明显抑制作用高脂饮食金黄地鼠给予阿托伐他汀9天后,肝脏MRC Ⅰ和IV活性与高脂饮食对照组相比分别降低41.61%和
36.06%。

双环醇(200 mg/kg)预防给药可显著增加MRCⅠ和MRC Ⅳ活性,使之恢复到正常水平。

阿托伐他汀引起的高脂饮食／肝损伤金黄地鼠肝脏线粒体还出现对
R123的摄取量明显减少,对高钙诱发肿胀的敏感性显著降低,提示线粒体发生了膜渗透性转换。

双环醇(200mg/kg)给药后可显著改善受损的线粒体功能。

本研究应用HepG2细胞建立了阿托伐他汀细胞损伤模型。

应用此细胞模型探讨了双环醇对阿托伐他汀引起的HepG2细胞凋亡的影响。

研究结果表明：1)阿托伐他汀(100μM)对HepG2细胞具有明显的损伤作用,细胞存活率下降为对照组的48.7%,显微镜下可见细胞出现皱缩、细胞核膨胀等形态学改变。

双环醇(1、50、100μM)可显著抑制阿托伐他汀引起的细胞存活率下降,并呈一定的量效关系,细胞形态学改变也明显减轻。

2)阿托伐他汀(100μM)可引起HepG2细胞中参与细胞凋亡最主要的终末剪切酶Caspase-3/7活性明显升高,为正常对照组的1.51倍。

双环醇(100μM)可显著抑制阿托伐他汀引起的细胞Caspase-3/7活性的异常升高。

3)细胞线粒体膜电位检测和AO-EB双荧光细胞核染色实验结果表明,阿托伐他(100μM))处理HepG2细胞后,细胞发生早期凋亡。

双环醇(100 μM)可明显抑制阿托伐他汀引起HepG2细胞的凋亡。

4)阿托伐他汀给药后,细胞浆内无活性的RhoA蛋白表达量显著升高,为正常对照的1.86倍,双环醇(100 gM)可显著抑制RhoA蛋白的表达上调,使其表达水平趋于正常。

此外,本研究可见HepG2细胞经阿托伐他汀(100μM)处理后,RhoA活性下降至正常细胞的48.46%。

双环醇(100 μM)对阿托伐他汀引起的细胞RhoA活性的下降具有明显的保护作用。

由此可见,双环醇对阿托伐他汀引起的高脂饮食金黄地鼠肝损伤和HepG2细胞损伤具有良好的保护作用。

双环醇的保护作用机制与减轻氧化／硝化应激、抑制细胞因子表达、改善线粒体功能、调控RhoA功能和抑制细胞凋亡相关。

综上所述,双环醇对抗结核药(RIF、INH和PZA)和阿托伐他汀引起的DILI 具有明显的保护作用。

其不仅可抑制血清转氨酶、AKP和TBIL的升高、还可改善肝脏病理学损伤,其保护作用的机制可归纳为：1.代谢酶调控：抑制CYP2E1
活性并下调其蛋白的异常表达。

2. 改善氧化应激：抑制脂质过氧化,恢复GSH含量,改善抗氧化物酶SOD、GSH-px、CAT的活性。

3.改善硝化应激：抑制NO升高及iNOS/TNOS蛋白的过表达。

4.抑制炎症细胞因子表达：下调血清和肝脏TNF-α、IL-1β蛋白的过表达。

5.减轻线粒体损伤：维持线粒体膜完整性和正常膜电位,增加MRCI和IV活性。

6.调节凋亡和肝保护相关蛋白：提高细胞RhoA活性和促进肝脏HGF的表达。

上述研究为进一步了解双环醇的肝保护作用特点以及临床治疗DILI提供了有参考价值的实验依据。

Ⅱ抗HIV新化合物F18的代谢产物-M3与UGTs同工酶的相互作用F18是基于天然产物化学修饰的新型非核苷类抗HIV化合物。

药效学研究表明,其体外抗HIV活性及治疗指数均比天然产物高10倍。

F18与已上市药物奈韦拉平的抗HIV活性相当,并具有较好的协同作用,尤其是对临床主要耐药病毒株Y181C(对耐韦拉平等药物不敏感)也具有明显抑制作用,EC50小于lnM。

急性毒性实验表明,该化合物毒性较低。

因此,F18有望成为临床治疗艾滋病的新药。

前期药代研究结果表明,大鼠和人肝微粒体中可检出4个F18的Ⅰ相代谢产物,其中氧化脱氯产物M3为主要的Ⅰ相代谢产物。

大鼠口服F18后,代谢产物M3可进一步经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyltransferase, UGTs)催化生成葡萄糖醛酸结合物,但介入M3 Ⅱ相代谢的UGTs类型及M3对UGTs的影响尚不明了。

因此,本研究应用人肝微粒体和重组人源UGTs同工酶体外温孵体系,选择UGTs同工酶探针底物和抑制剂,鉴定了
参与M3 Ⅱ相代谢的UGTs同工酶类型,评价了M3对UGTs活性的体外抑制作用,并进一步探讨了M3与UGTs底物药物(MPA和AZT)的体外相互作用。

实验结果表明：1)在人肝微粒体和6个重组人源UGTs同工酶中,UGT1A1是参与M3 Ⅱ相结合反应的主要同工酶,UGT1A4、1A9和2B7部分参与。

2) M3(10、100μM)可显著抑制人肝微粒UGT1A9和2B7的活性(P<0.01),M3(100μM)对人肝微粒体UGT1A1和1A4也有一定抑制作用,抑制率分别为23.9%和17.5%。

在人源重组酶中,M3(10、100 gM)对UGT1A9和2B7的抑制作用较人微粒体中更为显著,对UGT1A3和1A6未见明显的抑制作用。

3)M3以混合性方式抑制人肝微粒体UGT1A9介导的霉酚酸(mycophenolic acid, MPA) Ⅱ相葡萄糖醛酸化反应,IC50值为0.39±0.06 μM (BSA+)和0.58± 0.14μM (BSA-), Ki值为16.60±2.31μM(BSA-)和1.19±0.26μM (BSA+)。

MPA对M3在人肝微粒体中的葡萄糖醛酸化反应未见明显影响。

4)体外人肝微粒体研究可见,M3和齐多夫定(zidovudine, AZT)以混合性方式相互抑制,M3
对AZT的抑制常数Ki为16.81±1.22 μM, AZT对M3的抑制常数Ki为902.0±21.1μM。

综上所述,UGT1A1是参与M3Ⅱ相葡萄糖醛酸结合反应的主要同工酶。

M3体外对UGT1A9和2B7具有较强的抑制作用。

M3对UGT1A9介导的MPA代谢和UGT2B7介导的AZT代谢具有抑制作用。

上述结果为研究临床M3引起药物相互作用的潜在可能提供了一定的参考依据。