§4.5毛细管电泳

电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子 强度的平方根成反比。在低pH条件下，硅氧层形 成分子（Si-OH），因而减少了表面电荷密度，故 电渗速度减小。如在pH 9的硼砂缓冲液中电渗速 度约2 mm s-1，而在pH 3介质中电渗速度减小约一 个数量级。影响电渗的一个重要因素是毛细管中因 电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于
app ep eo
根据以上的讨论，带正电荷的离子的μep＞0，μeo＞0， 故μapp总是为正号，离子向阴极移动；而带负电荷 的离子受电泳流的影响被阴极排斥，μep＜0，在高 pH条件下，若μeo＞μep，μapp仍为正号，离子仍然可 向阴极移动，但在低pH条件下，μapp可为负号，离 子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可
0.5psi)附近。
进样时间的取值在1～5s之间，有时可超过60s。利 用压缩空气如钢瓶气可以实现正压进样，并能和毛 细管清洗系统共享，多为商品仪器采用。负压进样 需要特别精密的控制设计，容易因泄露等原因出现 不重复进样。正、负压进样都需要密封技术。压力 进样没有进样歧视现象，但选择性差，样品及其背
电渗流的另一个特点是可以使几乎所有的样品组分 不管带电不带电、电荷大小、带负电还是带正电都 以同样的方向移动。各自组分在毛细管中的流出时 间（迁移时间）取决于电渗流速度和组分电泳速度 的矢量和。在一般情况下，电渗流方向从阳极到阴 极，且电渗速度大于电泳速度，所以阴离子（除无 机离子）也在阴极流出。因此，合理地利用电渗流 可以使阳离子、中性分子、阴离子实现同时分离分 析。
电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制， 属普适性方法，可实现完全自动化操作，也是商 品仪器必备的进样方法。不过电动进样对离子组 分存在进样偏向，即迁移速度大者多进，小者少 进或不进，这就是所谓的进样歧视现象，这种现
象会降低分析的准确性和可靠性。
图4.6 毛细管电泳仪进样方式示意图
⑵ 流体动力学进样 压力进样也叫流动进样，它要求毛细管中的填充 介质具有流动性，比如溶液等。当将毛细管的两 端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动， 将进样带入。在仪器的实际设计过程中，一般又 分为正向压力进样和负向的真空或虹吸进样三种 方式。可用三种方法产生：正压、负压(管尾抽吸) 或重力(虹吸)，压力取值一般在±3450Pa(～
解质产生焦耳热(自热)。
自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布，即管 轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度 升高呈指数下降，温度梯度使介质粘度在径向产生 梯度，从而影响溶质迁移速度，使管轴中心的溶质 分子要比近管壁的分子迁移得更快，造成谱带展宽， 分离效率下降。一般来说温度每提高1 ℃，将使淌 度增加2%。
图4.3 电渗产生示意图
粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和 电渗流(EOF)两种速度的矢量和。
正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流 出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移 速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电 渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳 流速度，故它将在中性粒子之后流出，这样因各 种粒子迁移速度不同而实现分离。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到 毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶 电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入 毛细管电泳中，又发展了毛细管电色谱，扩大了 电泳的应用范围。毛细管电泳技术兼有高压电泳 及高效液相色谱等优点，其突出特点是： （1）它是在内径10～200 μm的石英毛细管中 进行的，在毛细管中的散热性好，沿着管截面的 温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端 的工作电压，所加电压可达几十千伏。
（5）分辨率高，理论塔板数为每米几十万至几百 万。
（6）取样量少，有时只需几个纳升，流动相只需 几毫升，实验成本低、消耗少。
（7）操作模式多，开发分析方法容易，应用范围 极广。
毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血 浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实 验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核 酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、
边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近
温度低，中心温度高，结果使电渗速度不均匀而 造成区带变宽，分离效率降低。为此，应避免使 用过长和内径大于50μm 的毛细管柱，还应注意减 小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使 用良好的冷却系统。
CE 中观察到的离子淌度是离子的电泳淌度μep 和溶液的电渗淌度的矢量和。定义表观淌度为μapp， 则
电渗是区带毛细管电泳中推动流体前进的驱动力， 它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前 运动，使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。 它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。
但在高效液相色谱（HPLC）
中，采用的压力驱动方式使
柱中流体呈抛物线型，其中
心处速度是平均速度的两倍，
导致溶质区带本身扩张，引
（2）不需要阻流介质，但可使用凝胶（或大分子介 质）作分子筛介质。
（3）使用在线柱检测法，缩短分析时间，结合计算 机处理数据，实现自动化操作。
（4）灵敏度高，检测方式多，检测器除了未能和原 子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已 和CE实现了连接检测。检测限可达10-13～10-15 mol， 使用激光诱导的荧光检测限可达10-19～10-21 mol。
§4. 5 毛细管电泳
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又称 为高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE), 是近年来发展最快的分析 方法之一。毛细管电泳技术是一类以毛细管为分 离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中 各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现 分离的一类液相分离技术，它使分析技术从微升 水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子 分析成为可能。
⑦改变毛细管内壁的表面电荷。
三、毛细管与焦耳热 在内径很细的毛细管中进行电泳分离与传统
电泳比较，主要是减少了焦耳热的影响。焦耳热 会引起电泳分离介质的温度梯度、粘度梯度和速 度梯度，从而引起区带展宽。毛细管允许高电场 下电泳分离，但焦耳热的产生使高电场的使用受 到限制。高场强导致电流增加，引起毛细管中电
电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳中的基本操作 要素，为了优化分离条件，往往需要控制电渗流。 控制电渗流最基本的方法有：①电压增加，EOF 增加；②缓冲溶液的pH增加，EOF 增加；③缓冲 溶液的离子强度越大，浓度越高， EOF 越大；④ 粘度越小EOF的速度或淌度越大；⑤温度越高， EOF越大；⑥在缓冲溶液中加有机/无机改性剂；
起柱效下降，使其分离效率
不如CE。图4.4为毛细管电
泳电渗流和高效液相液体流
的比较，这是毛细管电泳获 图4.4 电渗流与液相色谱流
得高效分离的重要原因之一。
比较示意图
电渗的大小可用电渗速度或电渗淌度来表示：
veo


E（4.16）源自eo （4.17）
式中veo为电渗速度，eo为电渗淌度，为双电层 的Zeta电位， 为分离介质的介电常数。
酶、碱氨基酸、微量元素、维生素、杀虫剂、染
料、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA 序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，甚至可 用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离 子/有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用 和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则 可用于手性分离中性化合物。由于技术本身优势 以及分离生物大分子的能力, 使CE成为常用分析 方法之一。
二、电渗 电渗或电渗流(electroomotic flow, EOF)是指
管内溶液在电场作用下整体朝一个方向运动的现 象, 可控制组分的迁移速度和方向，进而影响毛 细管电泳的分离模式、分离进程和分离重现性等。
对于石英毛细管来说，pH>3情况下，由于硅 醇基（－SiOH）电离成SiO-，使管壁表面带负电， 为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳 离子）被吸附到表面附近，形成双电层。在高电 压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体 地朝负极方向移动。如图4.3所示。
§4. 5. 1 毛细管电泳的基本原理
一、电泳淌度
毛细管电泳分离是基于组分固有的淌度不同， 在电场作用下形成不同迁移速度而进行的。一 个离子在电场下的迁移速度为：
v eE
式中 v 为离子移动速度，e为电泳淌度, E 为电
场强度。电泳淌度是一常数。半径小、电荷大 的离子具有较大的电泳淌度；而半径大、电荷 小的离子具有较小的电泳淌度。电泳淌度的差 异，构成了电泳分离的基础。
焦耳热和温度梯度的控制方法：①降低电压； ②降低离子强度；③降低缓冲溶液浓度；④减小毛
细管内径；⑤采用毛细管温控系统。
四、分离效率和分离度 分子扩散与理论塔板数：在CE中，仅存在纵 向扩散，扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离 效率高，分离生物大分子的依据。沿用色谱的理 论塔板数来表示电泳分离效率，则
R 0.177 apVLef 平均 DL
平均

ap1
2
ap2
（4.23） （4.24）
影响分离度的主要因素：工作电压V，毛细管有效 长度与总长度比，有效淌度差。
分离度可按谱图直接由下式计算：
R tm2 tm1 (W1 W2 ) / 2
（4-25）
式中tm1、tm2为两个组分迁移时间，W分别代表两 个组分峰底宽度。
§4. 5 .2 毛细管电泳的仪器与操作 毛细管电泳仪器主要包括进样系统、毛细管、
高压电源、缓冲液池、检测器和数据处理系统， 如图4.5所示。
图4.5 毛细管电泳仪结构示意图
一、进样技术 在毛细管电泳中常采用的进样方式为电迁移进
样和流体动力学进样，如图4.6所示。为了保持高效 率，取样体积应控制在10 ml以内，进样体积对毛 细管电泳效率有显著影响。减少注入管内的样液体 积，将会增加分离效率。一般说来，样品组分带所 占管长应少于总管长的1%～2%。
eo

中性
E

Ld t
V t
（4.20）
CE的毛细管容易冷却，故可以使用20～30 KV 的高电压，由于管内径只有25～100 μm，无涡流扩 散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。 电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离 的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池， 电泳过程与结果分析均容易自动化。因此CE已成 为效率极高的现代分析仪器，在生物化学与分子生 物学中得到日益广泛的应用。
传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的 焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3 mm 的毛细管中做自由溶液的区带电泳。现代毛细 管电泳技术是由Jorgenson和Lukacs在1981年首 先提出，他们使用了75 mm的毛细管柱，用荧光 检 测 器 对 多 种 组 分 实 现 了 分 离 。 1984 年 Terabe 将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的 重要分支：胶束电动毛细管色谱。
N ( l )2

σ2=2Dt，
（4.21）
式中 N 为分离效率， l 为毛细管有效长度。
实际的分离效能理论塔板数可以直接从电泳谱 图中求得：
N 5.54( tm )2 W1
2
式中tm为迁移时间，W1/2为半峰宽度。 分离度：与色谱分离一样，用峰分离度可以表 示电泳分离质量的好坏。
分离度R定义为：
⑴ 电迁移进样 进行电迁移法注样时，将含样品液的储瓶代替
一端的缓冲液储瓶，并通过样液瓶引入高压电， 电路按一定的时间周期接通，一般是几秒钟接通 一次，以使得进入毛细管的样品区带变窄。然后 断电，并将缓冲储瓶代替样液瓶，再通入高压电， 使电泳过程开始。为使电压沿管线分布均匀，应
使样液与缓冲液有相近的电导率。
检测到欲分析的离子。
对于实际淌度为μnet （net 指 net speed）的组 分，表观淌度可由下式计算：
app

net
E

Ld t
V t
（4.19）
式中Ld：从进样口到检测器的实际柱长； V：电压；
t：所需的分析时间。
实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时μep=0, μeo=μapp, 上式为：