基因操作及其医学应用

真核基因组 Eukaryote Genome
基本结构：
•结构基因（structural gene）指能转录成为mRNA、
rRNA或tRNA的DNA顺序。
•结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成
几段，编码序列称为外显子(exon)，其间的序列称为内
含子(intron),称为断裂基因（split gene）。
转基因及 基因治疗
转基因的基本方法
优势： ① 整合率高; ② 对外源DNA影响小; ③ 单拷贝整合，利于表达调控； ④ 安全。
转基因及 基因治疗
转基因的基本方法
劣势： ① 容量小; ② 只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因; ③ Transite expression; ④ R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。
What is the Genome?
基因组（genome） 指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物
质的总和，包括全套基因及间隔序列。
人类基因组包含22条常染色体和XY两条性 染色体（核基因组）以及线粒体上的遗传 物质（线粒体基因组）。
原核基因组和真核基因组
真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结 构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每 个复制子大小不一
质粒（plasmid）
是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价 闭合环状的双链DNA分子，大小在1—200kb之 间，能独立复制的最小遗传单位。
质粒的分类
➢ 克隆载体(cloning vector,Puc18,19)都有松弛的复 制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。 带有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用来克 隆和扩增基因片段。
地中海贫血
(中国)
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
4．神经系统疾病的基因治疗
病种
靶基因
方法
早老性痴呆
NGF 或其他营养因 替代细胞移植或直接注射载体于基底前
子
脑或皮层
帕金森病
氨酸羟化酶
替代细胞 移植或直接注射载 体于基底神
经节或中脑
神经损伤
生长因子或营养因 替代细胞移植或直接注射载体于受损区
子
的筛选
获取目的基因
PCR法
聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR）是在体 外进行的由引物介导的 酶促DNA扩增反应。是 获取已知序列候选基因 的主要方法。
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
转基因的基本方法
1、病毒法(Viral) 1)逆转录病毒(Restrovirus) RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell
转基因及 基因治疗
基因治疗的基本类型
★ 体内直接转基因治疗（in Vivo）
是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉、 乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持久。 但转移和表达效率低。
4) 组织内直接注射(Direct injection of DNA)
5) 磷酸钙沉淀法(CaPO4 precipitation)
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
1、肿瘤的基因治疗 1) 肿瘤的免疫基因治疗 ． ★载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞: 肿瘤浸润淋巴细胞(TILs) 淋巴因子激活的杀伤细胞(LAKs) 细胞因子:IL-1,2,4,6,7, IFNs，TNF-α,CSF。 ★肿瘤疫苗: 改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应
诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤HIV感染细胞
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
2）干扰病毒复制
★核酸(Ribozyme): Ribozyme gene→HIV患者CD4→ 破环基因完整性
★反义药物 GEM-91: 25bps反义寡核苷酸 封闭 HIV gag蛋白 mRNA
抑制HIV复制
转基因及 基因治疗
昆虫表达系统 酵母表达系统
在原核表达体系（以Ecoli为代表）：
优点
1.遗传背景清楚,易于调控; 2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代; 3.目的基因表达水平高, E.coli培养周期短，“物美价廉”.
缺点 1. 缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键
形成等; 2. 表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能恢复构象与活性； 3. 宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或
脂蛋白, 酌情选择真核表达载体。
真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物细胞）
优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻
译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包 涵体，能正确折叠。
缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较
低。
转基因和基因治疗
内容提纲
转基因和基因治疗
1．概念和研究现状 2．基因治疗的基本类型 3．转基因的基本方法 4. 转基因的表达和调控 5．基因治疗的运用和前景
基因操作的 基本策略
基因操作的概念
定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗
传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA
重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病
毒等载体中，形成遗传
物质的新
组合，然后
转移到宿主细胞产生
新的表型。
What is the Gene?
基因（gene）
是核酸链上贮存遗传信息的遗传单位，是贮存 有功能的蛋白质多肽信息及表达这些信息所必 需的全部核苷酸序列。
非编码区
剪切
编码区 intron 编码区
exon
exon
mRNA Protein
•有大量重复序列
获取目的基因
获取目的基因常常是化学合成法
较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物
测序ackaging Cell，欠安全
⑤ 有较强免疫原性，易引起体内免 疫反应
转基因及 基因治疗
转基因的基本方法
2、非病毒法(Nonviral)
1）显微注射法(Microinjection)
2) 基因定位整合技术(Gene targeting)
3) 受体介导(Receptor-mediated methods)
限制性核酸内切酶酶切
单酶切
❖ 用一种限制酶 酶切目的基因 和载体
❖ 易发生自身连 接
双酶切
❖ 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体
❖ 不易发生自身 连接
接:
“分子针线”
目的基因片段与载体的连接
★ 粘末端法：碱性磷酸酶退火 ★ 平接法：T4噬菌体DNA连接 ★ 接头法：人工合成R.E识别顺序
★ 聚尾法：分别加连polyA(T)或G
筛:
1. 阳性重组体的筛选 抗药基因 抗Ampicilin基因 Ampicilin敏感受体细胞 ＋ Ampicilin 培养基 ↓ 未转化菌落不能存活
2.颜色反应 Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶 利用 Xgal
蓝色/白色
3 影印原位杂交（Situ Hybridization) 菌落ＤＮＡ
苯丙氨酸羟化酶 重组肝细胞移植或直接注射载体于肝部
Lesch-Nyhan 病 HPRT
替代细胞移植或直接注射载体于脑部
人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含3~4 万个基因。
大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。
原核基因组 Prokaryote Genome
•基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。 •基因组中只有1个复制起点。 •基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为 单拷贝。 •基本结构特点：启动子（promoter）、操纵基因 （operator）、调控序列、结构基因（structure gene）、终止子（terminator）。 •基因序列是连续的，无内含子结构 •连续密码区 mRNA → Protein
转基因及 基因治疗
基本概念
• 基因治疗是以正常基因替代或置换靶细胞 染色质基因组中的致病基因从而产生新表型 的治疗方法。
• 转基因技术则是将目的基因导入靶细胞以 建立治疗效应的方法和过程。
转基因及 基因治疗
基因治疗的程序
目的基因
viral nonviral
转基因
In vivo ex vivo
基因表达
分三类，常用为Ⅱ类酶
识别序列呈回文对称（palindrome sequence）
–5’GAATTC 3’ 3’CTTAAG 5’
5’GGATCC 3’ 3’CCTAGG 5’
EcoRⅠ的识别序列
5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’
HaeⅠ的识别序列
5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’
预变性
94oC5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
基因重组
基因操作的关键步骤和核心内容 关系到研究的成败或质量 包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛选
分:
切:
“分子手术刀 ”
限制性内切酶
限制性核酸内切酶命名
• Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水号
举例： 流感噬血杆菌d株
（Haemophilus influengae d）
Hind Ⅰ
Hind Ⅱ Hind Ⅲ Hind Ⅳ
5’AAGCTT 3’ 3’TTCGAA 5’
限制性核酸内切酶 restriction endonuclease
在特异位点上切割DNA分子
基因治疗的应用
3）其它传染病基因治疗： HBV 流感病毒 单纯疱疹病毒 流行性出血热 水泡性口炎病毒
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
3．遗传病的基因治疗
腺苷酸脱氨酶缺乏症(ADA) (欧盟、美国)
囊纤维变性(CF)
(美国、英国)
人家族性高胆固醇血症(FH) (美国)
血友病B-IX因子成纤维细胞表达 (中国)
原位固定
硝酸纤维滤膜
重组探针杂交
阳性重组体
基因操作的 基本策略
4. 斑点杂交 ( Dot Blots ) 已知重组DNA
方阵打点
滤膜
阳性重组DNA探针杂交
重组DNA同源性和特异性
5. southern杂交
DNA片段吸印 重组探针杂交 后处理
外源基因表达
克隆基因在原核细胞中表达 克隆基因在哺乳动物细胞中表达 克隆基因在其它表达系统中表达
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
2)反义技术抑制肿瘤基因功能 人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互补寡核苷
酸，“封闭”癌基因的转录或翻译。
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
3)病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT)
---
“自杀基因”(Suicide gene)
该基因编码的酶能活化无毒药物前体杀伤该酶所在 的细胞。将“自杀基因”转染肿瘤细胞，使用对正常 细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
(肝癌细胞）单纯疱疹胸苷激酶(HSV-Tk)
活化
甲氧嘌呤阿拉伯糖苷
AM(D.T) 阿拉伯糖苷酸 杀伤肝癌细胞（无毒前体）
转基因及 基因治疗
基因治疗的应用
2．传染病基因治疗 1）刺激更强的机体抗HIV免疫反应
(HIV患者)成纤维细胞
R.V达载体(Expression vector,PET30a,pMV361)除 了有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所 必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强 大的启动子(Trp,Lac)。
转:
重组DNA的转化与增殖 制 备 Competence Cell （ 氯 化 钙 处 理 幼 嫩 E.coli,yeast,动物cell,昆虫.) C ． Cell--R.DNA——>”Hot shock”(42℃ ， 2’) ——>L．B．Culture-->37℃，lhr． -->LB．agar．plate --> genomic library．
体内调控
基因治疗
基因治疗的基本类型 ★细胞介导的基因治疗(ex Vivo)
是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进 行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原 代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（Transit)。
★体外表达基因治疗 (in Vitro)
是传统的基因表达形式。
转基因及 基因治疗
转基因及 基因治疗
转基因的基本方法
2） 腺病毒(Adenovirus) 腺相关病毒(Adenoassociated virus) DNA病毒 E1和E3基因缺乏 263细胞系生长
转基因及 基因治疗
转基因的基本方法
特点：
① 能感染静止细胞，体内(in vivo) 转基因
② 对某些细胞类型特别亲和力，利 于局部基因治疗