常见蛋白质标签

常见蛋白质标签总结
2008-12-08 22:06
Protein tags are peptide sequences genetically grafted onto a recombinant protein. Often these tags are removable by chemical agents or by enzymatic means, such as proteolysis or intein splicing. Tags are attached to proteins for various purposes.
一、氨基酸标签（含小肽标签）
A stretch of amino acids is added to the protein and enables the recovery of the labelled protein by its unique affinity. Usually its easiest to add the tag to either end of the protein to ensure its accessibility and not to disturb the protein folding.
组氨酸标签（His tag）一般为6个组氨酸，用Ni2+ （Cu2+）亲和层析纯化
FLAG tag ：N-DYKDDDDK-C ，recovered with specific antibody
HA tag：an epitope derived from the Influenza protein haemagglutinin (HA，禽流感病毒血凝素)，e.g. N-YPYDVP-C，recovery with an HA antibody
MYC tag：an epitope derived from the human proto-oncoprotein MYC，e.g.
N-ILKKATAYIL-C, N-EQKLISEEDL-C，recovery with an MYC antibody
SBP tag：Streptavidin Binding Peptide，链霉亲合素结合肽，38 amino acid tag (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)，更多参考在Sigma
CBP tag：钙调蛋白结合肽（CBP; 26aa）钙调蛋白结合肽与钙调素结合是Ca2+依赖的，这种结合不受标签所处的位置影响（N端和C端均可），在中性pH条件下使用2mM EGTA可以很方便的将目标蛋白洗脱下来。

这一系统有如下优点：1 特异性很高，因为大肠杆菌没有可以和钙调素结合的蛋白；2 与His标签相比可以在强还原性条件下纯化。

纤维素结合肽（CBD）：能与纤维素介质特异性的结合，可以在温和的条件下洗脱（乙二醇或低盐条件），pET CBD 载体含有纤维素结合肽（CBD）的序列，可方便构建。

二、蛋白质标签
Rather than adding only a few amino acids a whole protein is fused to the protein to be purified or detected. The affinity of the attached protein enables the recovery of the artificial fusion protein. As for the peptides, the protein tag is added to either end of the target protein.
GST tag：the small glutathione-S-transferase (GST; 26 kDa)，recovery by affinity to substrate glutathione bound to a column, e.g. glutathione sepharose
MBP tag：麦芽糖结合蛋白（MBP; 40kDa）载体：pMAL
IMPACT：Intein-Mediated Purification with an affinity Chitin-binding Tag（几丁质结合肽）
硫氧还蛋白：Thioredoxins are proteins that act as antioxidants by facilitating the reduction of other proteins by cysteine thiol-disulfide exchange.
Protein A：a 40-60 kDa MSCRAMM surface protein originally found in the cell wall of the bacteria Staphylococcus aureus. It has found use in biochemical research because of its ability to bind immunoglobulins. It binds proteins from many of
mammalian species, most notably IgG’s. It binds with the Fc region of immunoglobulins through interaction with the heavy chain.
Protein A/G：a recombinant fusion protein that combines IgG binding domains of both Protein A and Protein G. Protein A/G contains four Fc binding domains from Protein A and two from Protein G, yielding a final mass of 50,460 daltons. The binding of Protein A/G is less dependent upon pH than Protein A, but otherwise has the additive properties of Protein A and G. Protein A/G binds to all subclasses of human IgG, making it useful for purifying polyclonal or monoclonal IgG antibodies whose subclasses have not been determined. In addition, it binds to IgA, IgE, IgM and (to a lesser extent) IgD. Protein A/G also binds to all subclasses of mouse IgG but does not bind mouse IgA, IgM or serum albumin.
GFP：绿色荧光蛋白（GFP; 26.9 kDa）GFP and its variants are the most commonly used fluorescence tags.
三、化学标签
biotin - streptavidin （生物素- 链霉亲合素）
linking amino acids, often lysines, to cofactor and vitamin biotin purification by tight binding to streptavidin-agarose or -beads.
Streptavidin is a 53,000 dalton tetrameric protein purified from the bacterium Streptomyces avidinii. It finds wide use in molecular biology through its extraordinarily strong affinity for the vitamin biotin; the dissociation constant (Kd) of the biotin-streptavidin complex is on the order of ~10-15 mol/L, ranking among one of the strongest known non-covalent interactions.
Streptavidin is much less soluble in water than avidin, and it lacks avidin's extensive glycosylation. Streptavidin has a mildly acidic isoelectric point (pI) of ~5.
蛋白标签
蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。

目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。

美国GeneCopoeia（复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag™、Halo Tag™、AviTag™、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。

以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。

TrxHIS
His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。

当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。

组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：
∙标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；
∙His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；
∙His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；
∙His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

∙可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
∙可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag标签蛋白
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
∙FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

∙融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

∙FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

∙融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。

因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

MBP（麦芽糖结合蛋白）
MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。

MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。

MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。

有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。

如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。

结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。

结合亲和力在微摩尔范围。

一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。

缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。

如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。

将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。

GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。

结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。

在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。

GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。

标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。

在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione sepharose)亲和树脂进行纯化。

GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。

GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。

易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc
C-Myc 标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile- Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。

C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

eGFP
eGFP标签蛋白，是增强型绿色荧光蛋白eGFP,激发波长为488nm，发射波长为507nm，其是由野生型绿色荧光蛋白GFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。

相对于GFP，eGFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

eGFP 作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
∙不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

∙其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

∙同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

∙其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。

因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

此外由我公司提供的IRES双顺反子载体，可同目的基因共表达eGFP，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

eYFP
eYFP标签蛋白为增强型黄绿色荧光蛋白eYFP，激发波长为513nm，发射波长为527nm，其是由野生型黄绿色荧光蛋白YFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。

相对于YFP，eYFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eYFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

eYFP 作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
∙不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

∙其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

∙同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

∙其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。

因此现eYFP 表达标签被广泛的应用与基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

此外由我公司提供的IRES双顺反子载体，可同目的基因共表达eYFP，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

eCFP标签蛋白为增强型青色荧光蛋白eCFP，激发波长为433nm或453nm，发射波长为475nm或501nm，其是由野生型青色荧光蛋白CFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。

相对于CFP，eCFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eCFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

eCFP作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：
∙不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

∙其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

∙同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

∙其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。

因此现eCFP 表达标签被广泛的应用与基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

Avi Tag
AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。

融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大优点:
∙无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；
∙生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；
∙生物素Avi Tag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

SNAP-Tag
SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA- alkyltransferase）获得。

无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。

SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。

这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。

苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。

检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。

它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag
HaloTag™标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag™配基有效地共价结合。

这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag™配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag™蛋白共价结合。

这些配基由两个关键组分组成：(1)一个通用的HaloTag™反应联结子，结合HaloTag™蛋白；(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag™蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SUMO
SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。

在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。

研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。

因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。

切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。

所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

荧光素酶（Luciferase）
荧光素酶不是标签蛋白，但是由我公司提供的IRES载体，可同目的基因共表达萤火虫荧光素酶基因，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

荧光素酶（Luciferase）能催化荧光素氧化，在氧化的过程中，发出生物荧光，然后通过荧光测定仪或液闪测定仪就可以测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。

荧光素酶的优势在于发生物荧光，无需激发，无本底的影响，所以相关线性程度高；而且萤火虫荧光素酶在一般细胞中不会出现；荧光素酶分析的灵敏度很高，也容易操作；生物荧光的测定用简单的手动或全自动的微孔板化学发光检测仪都可以用；适合高通量筛选。