石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。

它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。

下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

步骤一：蜡块去蜡
石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。

因此，第一步是将蜡块去蜡。

首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。

然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。

这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。

步骤二：样本再固定
在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。

常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。

固定后，将样本从福尔马
林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。

步骤三：切片制备
在样本再固定后，需要将样本制备成切片。

首先，将组织样本放
入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。

脱脂后，将样本放入苯骚酸
乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。

在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将
样本转移到石蜡中浸泡。

石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持
组织的结构。

最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制
备成为石蜡块。

之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。

切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。

步骤四：抗原修复
切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。

抗原修复是为了使
样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。

常用的抗
原修复方法有热处理和化学处理两种。

热处理通常是将切片浸泡在含
有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。

化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA
（乙二胺四乙酸二钠）溶液。

抗原修复的时间和条件需根据具体实验
的要求来确定。

步骤五：非特异性结合阻断
为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。

常
用的非特异性结合阻断方法是使用牛血清白蛋白（BSA）、牛血清或小
鼠血清等蛋白质的溶液进行阻断。

阻断溶液中的蛋白质可以与切片上
的非特异性蛋白质结合，从而将它们屏蔽掉。

步骤六：一抗孵育
在进行石蜡切片免疫组化染色时，首先需要用一抗与目标抗原结合。

一抗是用来识别目标分子的抗体。

将一抗稀释至合适的浓度后，
加在切片上，覆盖切片以确保一抗能够充分与抗原结合。

然后，将切
片放入湿润的孵育盒中，在4摄氏度或适当的温度下孵育12-24小时。

步骤七：洗涤
孵育完成后，需要对切片进行洗涤。

洗涤的目的是去除未结合的
一抗，并去除一抗残留的溶液。

洗涤一般使用PBS或其他缓冲盐溶液。

将PBS倒入孵育盒中，使切片浸泡至少3次，每次5-10分钟。

洗涤过程中注意避免切片的脱落。

步骤八：二抗孵育
洗涤完成后，需要进行二抗孵育。

二抗通常是与一抗来自不同种源的抗体，用于识别并结合一抗。

将二抗稀释至合适的浓度后，加在切片上，覆盖切片。

然后，将切片放入湿润的孵育盒中，在适当的温度下孵育1-2小时。

步骤九：洗涤
二抗孵育完成后，需要对切片进行洗涤。

洗涤的目的是去除未结合的二抗，并去除残余的溶液。

洗涤过程与一抗孵育后的洗涤步骤相同，使用PBS或其他缓冲盐溶液进行洗涤。

步骤十：检测标记物
在石蜡切片免疫组化染色中，常用的检测标记物包括酶、荧光剂等。

根据实验需求，选择合适的标记物。

在这一步骤中，将检测标记物添加到切片上，并将切片放入孵育盒中，在适当的温度下孵育一定时间。

步骤十一：显色或荧光观察
最后，根据检测标记物的性质进行显色或荧光观察。

如果使用酶
作为标记物，可以使用显色底物进行显色反应，观察目标分子的分布
和定位。

如果使用荧光剂作为标记物，将切片放在显微镜下观察荧光
信号的强度、位置和形态。

总结：
石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，通过使用抗体与
特定抗原的结合来实现目标分子的可视化染色和定位。

其主要步骤包
括蜡块去蜡、样本再固定、切片制备、抗原修复、非特异性结合阻断、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤、检测标记物、显色或荧光观察等。

这些步骤的成功实施对于石蜡切片免疫组化染色的成功和准确性至关
重要。