药物定量分析样品与分析方法验证

第四节 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝后 冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆或 血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析前处理技术
微量药物存在于大量生物介质中，若直接进行 测定，内源性物质可能干扰，药物浓度太低将 会达不到仪器灵敏度要求。因此，生物样品中 的药物必须经过分离、纯化与浓集，必要时还 需对待测组分进行化学改性处理，从而为最后 测定创造良好的条件。
第二节 定量分析方法的特点
二、光谱分析法 （1）紫外分光光度法
特点： 1.灵敏度高，10-4 -10-7g/ml。 2.准确度高，RSD%：2%-5%。 3.仪器价廉物美，操作简便，易于普及。 4.应用广泛。
第二节 定量分析方法的特点
二、光谱分析法 （1）紫外分光光度法
含量测定方法
1.对照品比较法 2.吸收系数法 3.计算分光分度法。 4.比色法
一、概述
原料:不经特殊处理直接测定 原料:经有机破坏后测定 制剂:排除处方中干扰组分
药物
二、不经有机破坏的分析方法
➢（一）直接测定法 ➢1.配位滴定法 ➢2.氧化还原法 ➢（二）经水解后测定法 ➢1.碱水解后测定法 ➢2.酸水解后测定法 ➢（三）经还原分解后测定
二、不经有机破坏的分析方法
➢ （一）直接测定法 ➢ 1.配位滴定法
第四节 体内药物分析简介
定义： 体内药物分析是通过分析手段了 解药物在体内数量与质量的变化， 获得各种药物动力学参数，代谢 的方式和途径等信息。
第四节 体内药物分析简介
任务： 1）进行体内各种体液、组织，器官和排泄物中药物及 代谢物的分离测定。 2）进行新测定方法的研究、开发，以供临床常规测定 之用。 3）进行分析质量管理工作，提高测定技术和效率，以 便获得迅速，准确，可靠的测定结果。 4）进行方法学研究，及时为相关学科的研究提供合理 的最佳分析条件与方法，估计、评定各种方法能达到 的灵敏、专属和准确的程度。 5）参与相关学科研究中对获得的分析结果的阐明工作， 使所得的测定数据更有助于说明问题。
第二节 定量分析方法的特点
一、容量分析法 （1） 适用于化学原料药的含量测定 （2）容量分析法的有关计算 （3）含量测定
二、光谱分析法 三、色谱分析法
第二节 定量分析方法的特点
一、容量分析法的特点
装置简单，操作简便、快速，方法耐用 性高，测定结果准确（RSD＜0.2%）； 专属性差，适用于含量较高的样品分析， 常用于化学原料药的含量测定。 掌握含量测定的计算公式和方法。
药品分析方法验证内容
耐用性
准确度
线性与线性范围
Text
精密度
检测限与定量限
专属性
第四节 体内药物分析简介
重要性： 为了达到药物在临床上的使用安全、合 理和有效，人们越来越要求了解和提供 药物在体内的更多信息，即需要对药物 及其制剂的体内吸收、分布、代谢和排 泄过程、作用机制及药物效应进行研究， 因而促使药物动力学、生物药剂学、临 床药理学等一些新兴边缘学科的发展与 建立。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
三、生物样品分析前处理技术
(一) 蛋白质的去除 （二）缀合物的水解 （三）有机破坏 （四）分离、纯化和浓集 （五）化学衍生化法
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
(一) 蛋白质的去除 目的： 1）使于蛋白质结合的药物释放出来，以便准确地测定药
物及其代谢产物的浓度。 2）减免后续溶剂萃取过程中乳化现象 3）保护仪器性能
二、不经有机破坏的分析方法
（三）经还原分解后测定法 ➢1.碱性还原后测定 ➢2.酸性还原后测定 ➢3.利用可游离的金属离子的氧化性测定
含量
三、经有机破坏的分析方法
➢一、湿法破坏 ➢二、干法破坏 ➢1. 高温炽灼法 ➢2. 氧瓶燃烧法
三、经有机破坏的分析方法
➢一、湿法破坏 凯氏定氮法
（Kjeldahl nitrogen determination) 适用：含氨基或酰胺结构的药物 原理:
二、不经有机破坏的分析方法
➢ （二）经水解后测定法
➢ 2.酸水解后测定法
➢
硬脂酸镁
➢ 【含量测定】 取本品约1g，精密称定，精密 加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml ，煮 沸至油 层澄清，继续加热10分钟，放冷至室温，加甲 基橙指示液1 ～2 滴，用氢氧化钠 滴定液 (0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液 (0.05mol/L) 相当于2.016mg 的MgO。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
凡是体内药物到达之处，如各种体液， 器官组织和排泄物等，都是体内药物分 析的对象。血液是最常用的生物样品。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(一)血液 (1)血浆 全血中加入抗凝剂(肝素、枸橼酸、草酸盐、 EDTA等），经离心后取上清液。 （2）血清 全血不加抗凝剂，由血液中纤维蛋白原等 影响下,引起血液凝结而析出的澄清黄色液体,离心后取 上清液。 （3）全血 加入抗凝剂混匀，以防凝血。
第二节 定量分析方法的特点
二、光谱分析法 （2）荧光分析法
特点 1.灵敏度高，10-10 ~ 10-12g/ml。 2.在低浓度溶液中进行。 3.在测定供试品溶液时,用基准溶液代替对照品溶液校正
仪器的灵敏度。 4.用荧光衍生试剂,提高分析方法的灵敏度和选择性。
第二节 定量分析方法的特点
三、色谱分析法
指试样中被测物能被定量测定的 最低量。
第三节 药品分析方法的验证 六、线 性
指在一定范围内，试样浓度与响 应值呈正比。
第三节 药品分析方法的验证
七、范 围
指一种分析方法的精密度，准确 度都符合要求的试验结果成线性 时供试物浓度的变化范围。
第三节 药品分析方法的验证
八、耐 用 性
指在测定条件有小的变动时，测 定结果不受影响的承受程度，为 于常规检验提供依据。
目的
证明建立和采用的方法适合相应检测的要求。
内容
准确度 精密度，专属性，检测限，定量限，线性，线性范围和耐 用性
第三节 药品分析方法的验证 一、准确度（Accuracy)
指方法测定的结果与真实值或参 考值接近的程度，用回收率表示。
第三节 药品分析方法的验证 二、精密度（Precision)
指平行测定的各测量值（实验值） 之间互相接近的程度。
（一）高效液相色谱法
特点
高灵敏度（ 10-12 -10-15g/ml ）、高选择性、高效能、 高速度及应用广泛。
第二节 定量分析方法的特点
三、色谱分析法
（一）高效液相色谱法
系统适用性 （1）理论板数 （2）分离度 （3）重复性 （4）拖尾因
子 含量测定方法 （1）内标法 （2）外标法
第三节 药品分析方法的验证
➢
葡萄糖酸钙
➢ 【含量测定】 取本品0.5g，精密称定，加水 100ml，微热使溶解，加氢氧化钠试液 15ml 与钙紫红素指示剂0.1g，用乙二胺四醋酸二钠
滴定液(0.05mol/L) 滴定至溶液自紫 色转变
为纯蓝色。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液 （0.05mol/L ）相当于22.42mg 的 C12H22CaO14.H2O。
二、不经有机破坏的分析方法
➢ （一）直接测定法
➢ 2.氧化还原法
➢
葡萄糖酸锑钠
➢ 【含量测定】 取本品约0.3g，精密称定，置 具塞锥形瓶中，加水100ml 、盐酸15 ml与碘 化钾试液10ml，密塞，振摇后，在暗处静置
10分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mo l/L)滴
定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至 蓝色消失，并将滴定的结果用空白 试验校正。 每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于 6.088mg 的Sb。
５）酶解法 最常用蛋白水解酶：枯草菌溶素 可使蛋白质分解而放出药物。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
(二) 缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，C质O葡O萄H糖，酸-N或H硫3，酸-形SH成的葡药糖物酸可苷与或内硫源酸性缀物合 物。 1）酸水解 2）酶水解
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
(一) 蛋白质的去除方法 1）加入与水混溶的有机溶剂
可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使 蛋 白质凝聚，进而使与之结合的药物释放出来。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
2）加入中性盐
可使溶液的离子强度发生变化，能使蛋白质 脱水后沉淀下来，离心后可获得含有药物及 其代谢物的上层清液。
Hale Waihona Puke 三、经有机破坏的分析方法一、干法破坏
氧瓶燃烧法 适用
含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴别、 限度检查或含量测定及药物中杂质硒的检查。
三、经有机破坏的分析方法
➢ 一、干法破坏 氧瓶燃烧法
碘苯酯 【含量测定】 取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法（附
录Ⅶ C）进行有机破 坏，用氢氧化钠试液2ml 与水10ml为吸收 液，俟吸收完全后，加溴醋酸溶液（取醋酸钾 10g ，加冰醋酸适 量使溶解，加溴0.4ml ，再加冰醋酸使成100ml）10ml，密塞， 振摇， 放置数分钟，加甲酸约1ml ，用水洗涤瓶口，并通入空气 流约3 ～5 分钟以除去剩余的 溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀， 用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L) 滴定，至近终点 时，加淀粉指 示液，继续滴定至蓝色消失,并将滴定的结果用空白试验校正。每 1ml硫代 硫酸钠滴定液(0.02mol/L) 相当于1.388mg 的 C19H29IO2。
第三节 药品分析方法的验证 三、专属性
指其它组分可能存在下，采用的 方法能准确测定出被测物的特性。
第三节 药品分析方法的验证
四、检测限（Limit of detection, LOD)
指试样中被测物能被检测出的最低 浓度或量。
第三节 药品分析方法的验证
五、定量限（Limit of quantitation, LOQ)
二、不经有机破坏的分析方法
（二）经水解后测定法
➢ 1.碱水解后测定法
➢
三氯叔丁醇
➢ 【含量测定】 取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5ml ， 溶解后，加20％氢氧化钠 溶液5ml ，加热回流15分 钟，放冷至室温，加水20ml与硝酸5ml ，精密加硝酸 银滴定液 (0.1mol/L)30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯 5ml ，密塞，强力振摇后，加硫酸铁铵指示液 2ml ， 用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果 用空白试验校正。每1ml的 硝酸银滴定液(0.1mol/L) 相当于6.216mg 的C4H7Cl3O.1/2H2O。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(二)尿样
尿药测定主要用于药物剂量回收，药物肾清除率、药 物体内代谢及 生物利用度研究，也可用于乙酰化代谢 快、慢型测定等。 尿样浓度与血样浓度相关性差。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
一、样品的种类
(三)唾液 唾液中的药物浓度通常与血液浓度相关，可用唾液中 的药物浓度来反应血浆浓度。 唾液的采集一般是在漱口后15分钟，收集，离心后， 取上清液。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
3）加入强酸 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀， 条件是pH值要低于蛋白质的等电点。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
4）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH值高于蛋白质的等电点时，蛋白质分 子中带负电荷的羧基与金属离子形成不溶性 的盐而沉淀。
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
(三) 有机破坏
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物 质葡萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合 物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节 生物样品分析方法的 基本要求
(四)分离、纯化与浓集 1、生物样本的分离与纯化 （1）液-液萃取（liquid-liquid
extraction,LLE） （2）液-固萃取（liquid-solid,LSE）
含氮药物与硫酸共热,将有机氮转变成无 机氨,然后测定氮的含量。
三、经有机破坏的分析方法
一、湿法破坏 凯氏定氮法 双氯非那胺
【含量测定】 取本品约0.3g，精密称定， 照氮测定法（附录Ⅶ D 第一法）测定。 每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L) 相当于 15.26mg 的C6H6Cl2N2O4S2 。