杜仲Fls基因的克隆及原核表达

杜仲Fls基因的克隆及原核表达
常立;李周岐;李煜;魏军坤;王淑惠
【摘要】[目的]克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析.[方法]以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.[结果]获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220 bp,ORF为1011 bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21 (DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44 ku处有特异性的蛋白条带出现.[结论]获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达.
【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2014(042)004
【总页数】8页(P102-108,116)
【关键词】杜仲;基因克隆;Fls基因;原核表达
【作者】常立;李周岐;李煜;魏军坤;王淑惠
【作者单位】西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.2
黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于植物中的天然次级代谢产物。

其中，黄酮醇(flavonols)是黄酮类化合物的重要组成，在已报道的黄酮类化合物中黄酮醇约占1/3。

黄酮醇不仅能影响花色的形成[1-2]，而且在植物抗紫外辐射、抵御微生物病虫害[3]、影响花粉生育率[4-5]等方面具有重要作用。

黄酮醇是二氢黄酮醇在黄酮醇合成酶(Flavonol synthase,FLS)的催化下合成的，
该酶是黄酮醇与儿茶素合成所必需的[6]。

而FLS是双加氧酶(dioxygenases)家族
的一员，Holton等[7]根据双加氧酶的保守序列设计简并引物，利用PCR技术从
矮牵牛(Petunia hybrida)中首次克隆出Fls基因。

目前，已经从烟草(Nicotiana tabacun)[8]、苦荞(Fagopyrum tataricum)[9]、金银花(Lonicera japonica)[10]等高等植物中克隆了Fls基因。

杜仲黄酮醇是杜仲的重要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化[8-9]、抗肿瘤[10-11]、治疗心脑血管疾病[12-13]等药理作用。

但是，杜仲黄酮醇合成酶基因尚未见研究
报道。

本研究从杜仲中克隆Fls基因，对其序列进行了分析和原核表达，以期为利用基因工程技术调控黄酮类化合物代谢、提高杜仲品质奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
以杜仲种子为材料进行组织培养，外植体生长20 d时，于紫外灯(波长253.7 nm，强度75 μW/cm2)下照射4 h，取叶片于液氮中迅速冷冻后，保存于-70 ℃冰箱中备用。

植物RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，胶回收试剂盒购自AXSEGEN公司，限制性内切酶购自NEB公司，SolutionⅠ、Prime STAR HS DNA Polymerase、RACE试剂盒购自TaKaRa公司，反转录试剂盒购自Thermo
scientific公司，DNA Marker、Protein Marker、DH5α感受态细胞、
BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，pUC-T载体等试剂均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 杜仲叶片总RNA的提取
参照OMEGA的植物RNA提取试剂盒的使用方法提取杜仲叶片总 RNA，用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3 引物设计与合成
根据GenBank已经公布的Fls基因序列，设计杜仲Fls基因cDNA 的保守区扩增引物(FLS-HF/FLS-HR)，用于扩增杜仲Fls基因的中间片段；根据获得的杜仲Fls 基因中间片段，设计引物 Long/3-GSP、NUP/3-NGSP和Long/5-GSP、NUP/5-NGSP，其中Long/3-GSP和NUP/3-NGSP用于Fls的3′RACE，Long/5-GSP和NUP/5-NGSP用于Fls的5′RACE。

pET-FLS-F/pET-FLS-R用于构建原核表达载体。

以上引物均采用Primer 5.0软件设计，由生工生物(上海)工程有限公司合成。

设计的引物序列见表1。

表1 本研究用到的引物序列Table 1 Sequence primers used in this study引物用途Application of primers编号No.退火温度/℃Tm引物序列
(5′→3′)Sequence(5′→3′)核心序列扩增Primer of core fragmentFLS-
HF52ATTTGTTCCATAWGATYTGGCCFLS-HRATCCTTGTACTTCTTRGTCTTG3′RACE第1轮扩增First amplification of 3′RACELong67CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT3-GSPAAGGAAGCAGTGGGTGGGGATGAC3′RACE第2轮扩增Second ampli fication of 3′RACENUP66AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3-NGSPAAACTATTACCCACCATGTCCTCGG5′RACE第1轮扩增First amplification of
5′RACELong64CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT5-GSPGTCTGATTTCATGCTCCGGTGGGGG5′RACE第2轮扩增Second amplification of 5′RACENUP68AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT5-NGSPAAACACAGGCCACGACATTCTAGTC构建原核表达载体Construction of prokaryotic expression vectorpET-FLS-
F60TCGGAATTCATGGAGGTGGAGAGAGTGpET-FLS-RCATCTCGAGTTACTGAGGAAGCTTGTTG
1.4 杜仲Fls基因全长的克隆
1.4.1 杜仲Fls保守序列的克隆按照Thermo scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明合成cDNA。

以此 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，引物为 FLS-HF 和 FLS-HR(序列见表1)。

PCR反应体系为25 μL：FLS-HF 和 FLS-HR 各1.0 μL(0.4 μmol/L)，反转录产物1.0 μL，双蒸水9.5 μL,Prime STAR HS DNA Polymerase 1
2.5 μL(下同)。

PCR 扩增条件：94 ℃预变性3 min；
98 ℃变性10 s，52 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min,30个循环；72 ℃再延伸5 min；加1.5 U 的Taq DNA Polymerase 72 ℃保温30 min，以在PCR产物上加入碱基 A，4 ℃保存。

PCR 产物用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像仪拍照。

1.4.2 杜仲Fls的3′RACE cDNA合成参照Thermo scientific公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit的使用说明完成。

以此cDNA为模板进行第1
轮PCR扩增(引物为3-GSP和Long)。

扩增条件：94 ℃预变性3 min；98 ℃变
性10 s，67 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min,共30个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

对上述 PCR 产物稀释50倍再进行巢式 PCR(引物为3-NGSP和NUP)。

扩增条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，66 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共
30个循环；72 ℃再延伸5 min；加1.5 U 的Taq DNA Polymerase 72 ℃保温
30 min，以在PCR产物上加入碱基A，4 ℃保存。

PCR 产物用15 g/L 琼脂糖凝
胶进行电泳检测，凝胶成像仪拍照。

1.4.3 杜仲Fls的5′RACE 按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的使用说明合成cDNA。

以此cDNA为模板进行第1轮PCR(引物为5-GSP和Long)。

扩增条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，64 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min,共30个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

对上述 PCR 产物稀释50倍后进行巢式 PCR(引物为5-NGSP和NUP)。

扩增条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，68 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min,共
30个循环；72 ℃再延伸5 min；然后加1.5 U 的Taq DNA Polymerase 72 ℃
保温30 min，以在PCR产物上加入碱基A,4 ℃保存。

PCR 产物用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像仪拍照。

1.4.4 PCR 产物的回收及测序 PCR 产物的回收按照 AXSEGEN 公司的说明书操作。

将回收产物连接pUC-T载体，并转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑和氨苄青霉素筛选后，随机挑取6个阳性转化子进行扩大培养和菌落 PCR 检测，并送样至生工生物(上海)工程有限公司测序。

采用DNAMAN软件对3′RACE和5′RACE测序结果的片段进行拼接。

1.5 杜仲Fls基因的序列分析
利用NCBI在线工具对杜仲Fls基因的ORF及其编码蛋白质的分子质量和等电点
进行预测；利用 DAS软件对其编码的蛋白质跨膜区进行预测；利用SOPM软件
对其编码蛋白质的二级结构进行预测；利用Clustalx 2与 MEGA4软件构建其编
码蛋白质的系统进化树，并计算进化距离。

1.6 杜仲Fls基因原核表达载体的构建
根据Fls基因ORF设计1对特异引物，分别为pET-FLS-F和pET-FLS-R(序列见
表1)，根据需要在其中加入酶切位点和保护碱基。

以5′RACE合成的cDNA为模
板进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸80 s,33个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像仪拍照。

将 PCR 扩增得到的杜仲Fls基因 ORF 和 pET-28a 用限制性内切酶EcoRⅠ和
XhoⅠ进行双酶切，酶切产物经切胶回收、连接，获得重组质粒 pET-28a-Fls，将其转化至原核表达细胞 BL21(DE3)，经蓝白斑和卡那霉素筛选，挑取6个阳性转
化子进行扩大培养，提取质粒，进行双酶切检测，并送样至生工生物(上海)工程有限公司测序。

1.7 杜仲Fls基因原核表达载体的诱导表达
测序鉴定 pET-28a-Fls 读码框正确后，将pET-28a和pET-28a-Fls菌液均转接到30 mL LB培养基中，其中菌液与培养基的体积比均为1∶50，振荡培养至菌液
OD600为0.8时，加入 IPTG 使其终浓度为1 mmol/L，将pET-28a-Fls 的菌液27 ℃诱导0，1，2，3，4 h后，分别取1.5 mL 菌液，4 ℃下12 000 g离心6 min，弃上清，加2×上样缓冲液200 μL，煮沸裂解5 min,4 ℃下12 000 g离心
6 min，用 SDS-PAGE 进行电泳检测，以pET-28a 的菌液2
7 ℃诱导4 h作为对照。

2 结果与分析
2.1 杜仲Fls基因全长序列的获得
2.1.1 核心序列的扩增结果以杜仲叶片总RNA反转录cDNA为模板，利用引物FLS-HF和FLS-HR进行扩增,经电泳检测获得长约600 bp的序列(图1)，此序列
与烟草[8]、苦荞[9]、金银花[10]等植物的Fls基因长度相仿。

将此序列回收、克
隆和测序，结果显示，该序列为578 bp；NCBI Blast比对结果表明，其与GenBank 中金银花Fls基因的同源性高达80%，确定此序列为Fls基因的一部分。

2.1.2 3′RACE扩增结果根据获得的杜仲Fls基因核心序列，设计2对3′RACE PCR引物，经第1轮PCR和巢式PCR后，扩增产物电泳检测获得约600 bp的序列(图2)，此序列与预期长度相似。

对此序列进行回收、克隆和测序，结果显示此
序列长579 bp，与核心序列可拼接上。

该序列经NCBI Blast比对，可知其与GenBank中金银花Fls基因的同源性为82%，确定该序列为Fls基因的一部分。

2.1.3 5′RACE扩增结果根据获得的杜仲Fls基因核心序列，设计2对5′RACE PCR引物，经第1轮PCR和巢式PCR后，对扩增产物进行电泳检测，获得约
950 bp的序列(图3)，此序列与预期长度相似。

将此序列回收、克隆和测序，结
果显示长967 bp，与核心序列可拼接上。

该序列经NCBI Blast比对，可知其与GenBank中金银花Fls基因的同源性为76%，确定该序列为Fls基因的一部分。

图1 杜仲Fls基因核心序列的扩增结果 M.DNA Marker;1,2.核心序列扩增产物Fig.1 Core-sequence amplification of Eucommia ulmoides Fls geneM.DNA Marker;1,2.Products of the conserved region图2 杜仲Fls基因3′RACE的扩
增结果M.DNA Marker;1,2.3′RACE产物Fig.2 3′RACE amplification of Eucommia ulmoides Fls gene M.DNA Marker;1,2.Products of 3′RACE
图3 杜仲Fls基因5′RACE扩增结果M.DNA Marker;1,2.5′RACE产物Fig.3
5′RACE amplification of Eucommia ulmoides Fls gene M.DNA
Marker;1,2.Products of 5′RACE
2.2 杜仲Fls基因的序列分析
将3′RACE与5′RACE的测序结果进行拼接，获得全长1 220 bp的杜仲Fls序列。

该序列包括1个完整的 ORF (56-1 066 bp)，编码336个氨基酸,在3′polyA 之前有明显的加尾信号AATAAA(图4)。

杜仲Fls基因的开放阅读框经翻译，获得了FLS氨基酸序列，此序列经 Blastn 分析，可知其FLS氨基酸序列与金银花、矮牵牛、马铃薯(Solanum tuberosum)等
的同源性均在70%～78%,其中与金银花的同源性最高，可达78%。

2.3 杜仲FLS蛋白的生物信息学分析
推测FLS氨基酸序列的分子质量为38.03 059 ku，等电点为5.59。

通过 DAS软
件分析，显示 FLS 有5个跨膜区，分别位于38-45(8)、177-184(8)、219-221(3)、223-232(10)及256-261(6)位氨基酸；通过SOPM软件分析，显示FLS蛋白的二级结构主要由随机卷曲(random coil，34.52%)、α螺旋(alpha helix，32.74%)、延伸链(extrend strand，25.30%)及β-转角(β-turn，7.44%)组成。

2.4 杜仲与其他植物FLS 氨基酸序列的系统进化分析
应用 Clustalx 2与 MEGA4 等软件，利用 Neighbor-Joining 方法构建杜仲 FLS
与 NCBI 中已经登录的12种高等植物FLS的进化树，结果(图5)显示：杜仲与烟草、矮牵牛、马铃薯、金银花最先归为一类，亲缘关系较近；然后与三花龙胆(Gentiana triflora)、洋桔梗(Eustoma grandiflorum)归为一类；而与毛果杨(Populus trichocarpa)和银杏(Ginkgo biloba)最后聚为一类，亲缘关系较远。

利用MEGA4 计算上述13种高等植物间的进化距离，结果(表2)表明，杜仲与烟草、矮牵牛、马铃薯、金银花的进化距离分别为0.256，0.236，0.256和0.236。

图4 杜仲Fls基因全长 cDNA 序列及其编码氨基酸序列起始密码子、终止密码子
用粗体标示，多聚腺苷酸加尾信号用斜粗体标示Fig.4 Full-length cDNA sequence and putative amino acid sequence of the Fls gene in Eucommia ulmoidesInitiation codon and termination code are in bold,and the putative poly(A) tail signal is in italic and bold
图5 杜仲与其他12种植物 FLS 氨基酸序列的系统进化树Fig.5 Phylogenetic
tree of the deduced amino acid sequences of Eucommia ulmoides and 12 other plants
表2 杜仲与其他12种植物FLS氨基酸序列的进化距离Table 2 Evolutionary
distance of the deduced FLS amino acid sequences of Eucommia ulmoides and 12 other plants注：1.西洋梨；2.毛果杨；3.三花龙胆；4.烟草；5.洋桔梗；
6.矮牵牛；
7.杜仲；
8.银杏；
9.马铃薯；10.苹果；11.金银花；12.金花茶；13.荞麦。

Note:1.Pyrus communis;2.Populus trichocarpa;3.Gentiana
triflora;4.Nicotiana tabacum;5.Eustoma
gr andiflorum;6.Petunia×hybrida;7.Eucommia ulmoides;8.Ginkgo
biloba;9.Solanum tuberosum;10.Malus×domestica;11.Lonicera
japonica;12.Camellia nitidissima;13.Fagopyrum esculentum.物种
Species12345678910111213120.45530.3380.37740.3900.3950.24050.3950. 4320.1340.26460.3810.3950.2320.1090.24870.3950.3900.2560.2560.2920.23 680.6750.6930.7300.7240.7630.7300.67590.3770.4180.2520.1340.2680.1370 .2560.737100.0250.4600.3330.3860.3550.3770.4040.6870.381110.4040.4270 .2720.1270.2720.2020.2360.6990.2130.404120.3720.4040.2600.2880.2800.2 920.2560.7050.2800.3680.264130.3550.4270.2920.3170.3420.3120.3120.712 0.3210.3510.3460.260
2.5 杜仲Fls基因原核表达载体pET-28a-Fls的鉴定
对重组质粒pET-28a-Fls进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，结果(图6)显示，酶
切片段长度为 1 011 bp，与预期结果一致,表明成功构建了 pET-28a-Fls 原核表达载体。

图6 重组质粒pET-28a-Fls的双酶切鉴定M.DNA Marker;1,2.重组质粒经
EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切产物Fig.6 Digestion identification of pET-28a-Fls
M.DNA Marker;1,2.Products of recombinant plasmids digested by
EcoRⅠand XhoⅠ
2.6 杜仲Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达
用原核表达载体pET-28a-Fls 转化表达宿主菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导表达，结果产生了分子质量约44 ku的特异蛋白，而对照不表达该蛋白(图7)。

除去3 ku 的融合标签，可推算出实际诱导表达的杜仲黄酮醇合成酶成熟蛋白的分子质量约为38 ku，与理论值基本一致。

从图7还可以看出，随着诱导时间的延长，FLS表达量逐渐增加，诱导约4 h时达到最大。

3 讨论
黄酮醇的主要成分是槲皮素和山奈酚，具有多种药学功能。

现代医学研究表明，黄酮醇具有抗病毒、抗菌消炎、抗过敏、抗氧化等作用[11-12]，对乳腺癌细胞、人
类肠道癌细胞及前列腺癌细胞等均有很强的抑制作用[13-14]，而且还可以预防和
治疗心脑血管疾病[15-16]。

FLS是黄酮醇合成的关键酶，在植物中非常保守[6]。

因此，本研究利用同源克隆
和 RACE 方法，从杜仲组培苗叶片中获得了黄酮醇合成酶基因Fls，全长1 220 bp，ORF为1 011 bp，共编码336个氨基酸；对该基因氨基酸序列的同源性分
析表明，杜仲作为第三纪孑遗植物[17]，其FLS与金银花的同源性最高，可达78%，而与烟草、高杯花、马铃薯、银杏(Ginkgo biloba)、淫羊藿(Epimedium grandiflorum)等其他已知物种的同源性也高达51%～77%，表明Fls基因在进化上很保守。

同时，对杜仲等13个物种 FLS 的系统进化树和进化距离进行分析，表明杜仲(绞木目)与烟草(茄目)、矮牵牛(茄目)、马铃薯(茄目)、金银花(川续断目)的
亲缘关系较近。

Singh[18]采用APGⅡ系统分类法，将绞木目与牻牛儿苗目、唇形目、茄目最先聚为一类，其次与川续断目、菊目聚为一类，最后与杜鹃花目、山茱萸目聚为一类。

本试验研究结果与前人的分类结果基本一致，支持APGⅡ分类方
法的结果。

黄酮类化合物具有独特的生物学特性和药用价值，其生物代谢途径是目前了解最清楚的次生代谢途径之一[2]。

因此，利用生物技术手段调控其生物代谢的报道越来
越多。

Nielsen等[1]利用基因沉默技术抑制洋桔梗Fls基因，使其花卉颜色由紫色变为了红色，并能稳定遗传。

Ryoji等[2]研究表明，Fls基因移码突变影响了大豆
花色。

Holton等[7]在烟草中表达矮牵牛的反义Fls基因，能够检测到花青素表达水平的提高。

另外，烟草、洋桔梗、矮牵牛在花苞将要开放时Fls基因表达量最高，但当花青素开始生成的时候，FLS的活性就开始迅速降低,这可能是因为2个利用
同一底物的酶进行空间竞争抑制调控所致，这为将来利用遗传操作手段调控杜仲黄酮类化合物的合成方向，增加杜仲中黄酮醇含量提供了可能性。

图7 重组质粒pET-28a-Fls融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测M.蛋白质标准
分子量;1.对照，pET-28a 诱导4 h;2.pET-28a-Fls诱导0 h;3.pET-28a-Fls诱导1 h;4.pET-28a-Fls诱导2 h;5.pET-28a-Fls诱导3 h;6.pET-28a-Fls诱导4 hFig.7 SDS-PAGE analysis of expressed products of recombinant pET-28a-Fls in E.coli BL21(DE3)M.Protein Marker;1.Control pET-28a induced for 4 h;2.pET-28a-Fls induced for 0 h;3.pET-28a-Fls induced for 1 h; 4.pET-28a-Fls induced for 2 h;5.pET-28a-Fls induced for 3 h;6.pET-28a-Fls induced for 4 h 随着转基因技术的发展，许多功能性基因被转入植物中，使其品质得到了提高[19-20]。

本研究从杜仲中首次克隆了Fls基因全长，这不仅为利用基因工程手段调节
杜仲中黄酮醇含量，提高杜仲品质奠定了基础，而且有助于对黄酮类化合物代谢调控机制和植物分子进化的进一步深入研究。

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