拟南芥发育异常突变体的基因克隆与表型分析

拟南芥发育异常突变体的基因克隆与表型分析
摘要
植物发育在器官、组织和细胞等不同层次上受到复杂的遗传互作网络调控。

本实验室的研究方向是利用正向遗传学方法探索植物非生物逆境响应相关发育性状形成的遗传基础和分子机制。

实验室在前期工作中，在激活标签突变体库中筛选获得一个拟南芥显性突变体abs3-1D(abnormal shoot3-1 dominant)。

abs3-1D突变体呈现株型小，叶柄短，叶片紧凑，颜色偏黄，开花明显提前，次生花序簇生，主花序茎矮化，短角果且种子的育性下降。

在黑暗诱导条件下，abs3-1D表现出叶片衰老加速的特征。

为进一步研究ABS3在植物发育过程的功能，以abs3-1D为遗传背景进行EMS(乙基磺酸甲酯, ethyl-methane sulphonate)诱变。

在诱变体库中筛选到能够逆转abs3-1D早花表型的突变体F08-69。

F08-69表现出晚花表型，并且F08-69single营养生长期延长，黑暗条件下叶片衰老速度减慢。

全基因组重测序鉴定出At3g10390基因+678bp处G变成A，导致甘氨酸(G)替换为丝氨酸(S)。

另外还发现叶色、叶形和表皮毛发育缺陷的突变，其中一株隐性突变体abt3-1(aberrantly branched trichome 3)，其突变表型为植株小，叶形宽，叶色浓绿，尤其是其出现了高比例的多分支的表皮毛，并且根的生长存在缺陷。

abt3-1根的伸长速率仅为Col-0的三分之一。

通过对根的分生组织中皮层细胞数目和细胞长度的测定，表明abt3-1根的分生区变短。

该研究利用图位克隆技术发现abt3-1中At1g66510的第8个外显子的+33bp处G突变为A，提前引入终止密码子。

回复验证表明At1g66510(ABT3)的突变导致了abt3-1的表型。

ABT3基因编码一个目前功能未知的AAR2(a1- 2 repression 2)家族蛋白。

我们同时对ABT3蛋白的亚细胞定位进行了观察，发现ABT3蛋白定位于细胞质和细胞核中。

关键词：拟南芥；衰老；表皮毛；图位克隆
GENE CLONING AND PHENOTYPIC ANALYSIS OF ABNORMAL MUTANTS FROM ARABIDOPSIS THALIANA
ABSTRACT
Developmental programs in plants are under the elaborate regulation of genetic interaction networks at organs, tissues and cellular levels. Our lab is interested in dissecting t he genetic basis and molecular mechanism of the plant developmental traits formation responsing to abiotic stress by the forward genetic method. Previous work has isolated a dominant Arabidopsis mutant abs3-1D (abnormal shoot3-1 dominant)from activation tagged mutant pools. abs3-1D displays short petiole, small plant type, compact yellow leaves, early flower, clustal secondary inflorescence, dwarf stem, short pods and poor fertility. In the dark induced senescence conditions, mutant abs3-1D showed a characteristic of accelerated leaf senescence. In order to further study the role of ABS3in plant development process, abs3-1D was mutagenized with EMS (ethyl-methane sulphonate).
The screened mutant F08-69 reverse the early flower of abs3-1D. F08-69 showed late flowering phenotype and F08-69single has a prolonged vegetative growth period and slow down leaf senescence in dark condition. Whole genome sequencing of F08-69single found that G changed to A in the +678bp position of At3g10390, leading to glycine (G) mutation into serine (S).
In addition, a large number of mutants involved in leaf color, leaf shape and trichome decelopment were screened in the mutant library. An Arabidopsis recessive mutant abt3-1(aberrantly branched trichome 3) was isolated from EMS mutagenesis mutant pools. abt3-1 has reduced stature, darker green and wider leaves. abt3-1 appeareed a high proportion of multi-branched trichomes and a defective primary root. The growth curves showed that mutant root growth rate was only one third of the wild-type. The meristematic zone of abt3-1 was reduced by measuring the number and the length of cortical cells in it. In this study, we found the G to A transition in the +33 position of exon 8 of At1g66510 by sequencing the candidate genes in the chromosome interval which was determined using the position cloning strategy, which resulted in a premature translation termination. Genetic complementation experiments further proved that the mutant At1g66510 (ABT3) leads to the phenotype in abt3-1. ABT3 encodes a currently unknown AAR2 (a1- 2 repression 2) family proteins. The subcellular localization of ABT3 protein was found in cytoplasm and nucleus using the protoplast transient expression system.
KEY WORDS:Arabidopsis thaliana, senescence, trichomes, position cloning
目录
第一章文献综述 (1)
1.1正向遗传学 (1)
1.2拟南芥表皮毛的发育研究 (2)
1.3拟南芥根的发育研究 (2)
1.4拟南芥花的发育调控 (2)
1.5图位克隆 (4)
1.6全基因组测序技术 (4)
第二章拟南芥abs3-1D逆转突变体的筛选与基因克隆 (6)
2.1材料和方法 (6)
2.1.1 实验材料 (6)
2.1.2 实验方法 (7)
2.2结果与分析 (9)
2.2.1 abs3-1D逆转突变体的筛选 (9)
2.2.2 F08-69single的粗定位 (11)
2.2.3 F08-69single测序样品制备 (11)
2.2.4 F08-69single全基因组测序结果分析 (12)
2.3讨论 (15)
第三章拟南芥表皮毛发育突变体abt3-1的克隆与表型分析 (16)
3.1材料和方法 (16)
3.1.1实验材料 (16)
3.1.2实验方法 (17)
3.2结果与分析 (23)
3.2.1 叶色突变体 (23)
3.2.2 表皮毛发育异常突变体 (24)
3.2.3 叶形异常突变体 (25)
3.2.4 表皮毛发育突变体abt3-1的筛选 (25)
3.2.5 abt3-1发育缺陷的主根 (26)
3.2.6 abt3-1的遗传分析 (28)
3.2.7 abt3-1的图位克隆 (28)
3.2.8 突变体的回复验证 (31)
3.2.9 ABT3进化分析 (32)
3.2.10 ABT3的亚细胞定位 (34)
3.3讨论 (35)
总结与展望 (36)
参考文献 (37)
致谢 (40)
作者简介 (41)
第一章文献综述 1
第一章文献综述
1964年以来世界人口数量增长了一倍，粮食缺乏的人口比例降低了75%，然而有近10亿的人口仍处于饥饿，大约20亿的人口微量营养不良（Godfray et al. 2010）。

预测显示2050年粮食作物的产量翻倍才可以满足人口增长和人均消费量增大的需要（Tilman et al. 2011）。

尽管四种主要作物玉米，小麦，水稻和大豆的种植量占到全球农业种植的三分之二，其产量趋势仍难以实现农业总产量翻倍的目（Ray et al. 2013）简单维持并不能解决实际需要，迫切要做的是加速粮食生产。

因此深入研究植物发育调控网络中限制产量和品质的生物学过程是实现粮食作物增产的一项重要策略。

1.1 正向遗传学
鉴定基因功能的方法中最有效和令人信服的即是在分子水平上确定某种表型的突变是由某个突变的等位基因导致的。

这种基因功能的发现方法最初称为遗传学，现在被称为“正向遗传学”，大大扩展了上个世纪我们对发育生物学，生理学和生物化学等领域的研究。

几十年来，正向遗传学一直是一个鉴定感兴趣的基因和有趣突变体的强大的技术。

正向遗传筛选在几乎所有的生物系统遵循相同的基本原则。

有明确遗传背景的生物使用DNA损伤诱变手段产生随机突变体，例如：辐照或化学诱变剂。

在突变库中筛选表型异常的植株。

寻找导致观察到的遗传突变表型的突变基因通常是多步骤的工程，涉及到遗传图谱定位携带突变基因的广泛染色体区间（即映射间隔），随后对于该区域内的候选突变进行目标搜索。

证实突变的候选基因引起了该突变表型的过程常常涉及确认突变体和野生型个体基因连锁关系，理想情况下也通过功能性的方法，例如通过外源转入该基因的野生型等位基因可以补充内源性破坏的等位基因以拯救其突变表型，回复为野生型。

通常某个突变基因导致的某种突变表型触发人们去研究该基因的分子角色和功能。

迄今正向遗传主要应用在可以直接诱导突变的经典的模式生物中，广泛范围的定义良好的菌株，基因组实用性操作技术方便表征和验证候选基因和突变。

正向遗传学表示自发诱变或者随机诱变得到具有特定表型的变异体，实现由表型到基因的研究。

反向遗传学与之相反，针对特定基因的诱变，例如引入点突或插入突变，观察相应表型改变实现对特定基因的研究。

由T-DNA或转座子引入遗传物质的改变越来越受到欢迎。

目前正在大规模进行插入诱变破坏拟南芥中大部分基因的工作（Sussman et al. 2000），利用这些群体进行突变体的筛选毋庸置疑是非常值得的。

然而，插入诱变往往会导致基因的完全敲除，除了导致死亡很难将突变表型与这些必须基因联系起来（Jander et al. 2002）。

相比起来，化学诱变能够诱发启动子突变或者基因编码区错义突变。

这种突变会产生亚效等位基因突变( hypomorphic mutation)导致蛋白质的功能下调而
2拟南芥发育异常突变体的基因克隆与表型分析
非无效等位基因突变( amorphic mutation)的蛋白质功能完全性缺失。

亚效突变使得大量富有研究价值的基因得以发掘。

例如拟南芥VTC1(CYT1)中的渗漏突变引起植物对于臭氧的敏感和维他命C水平的下降（Conklin et al.1999），但是敲除突变会导致胚胎致死（Lukowitz et al. 2001）。

化学诱变相较于插入诱变除了可以提高突变体的多样性，而且可以在单个植物中引入多个突变。

EMS在每个材料品系中可引入大量点突，如：G:C碱基对改变为A:T碱基对，因此一般可以从5000株植物得到任意指定基因突变。

1.2 拟南芥表皮毛的发育研究
表皮毛有分泌型的，也有非分泌型的，在某些物种中，它们可能提供机械障碍来保护植物免受昆虫的影响。

此外，表皮毛可以降低风速，并且因此可以维持一个高度水饱和的微环境，减少气孔失水，在其他物种中，表皮毛甚至可以反射过量的光，从而保护植物免受辐射损伤（Wagner et al. 2004）；分泌型的表皮毛所形成的的次生代谢产物广泛用于香料和医药等的生产（Jakoby et al. 2008）。

通常，突变体倍性水平的改变会影响表皮毛的分支数，使得DNA含量减少的突变体具有更少的分支，而倍性水平增加的突变体具有更多的分支（Folkers et al. 1997）。

一些突变导致有丝分裂向核内再复制的转变或者循环数改变。

如try突变体的表皮毛具有增加的分支和64倍的DNA含量，这表明一个另外的核内复制循环发生（Mathur and Chua 2000）。

1.3 拟南芥根的发育研究
根系除了锚定和支持植物之外，对于植物从土壤中吸收水和营养物至关重要。

形状良好的根系系统架构将有益于提高植物对环境的适应性（Aiken and Smucker 1996；de Dorlodot et al. 2007；Smith and De Smet 2012）。

静止中心（QC）远端的根尖分生组织（RAM）被称为近端分生组织，根尖分生组织（RAM）所包含的细胞由于细胞活性生长和分裂，细胞大小会有2倍的变化（De Smet et al. 2007；Perilli et al. 2012）。

离开近端分生组织的细胞开始在远端分生组织或过渡区中分化和延伸，并且通过快速伸长和分化的区域，最终成为完全伸长和分化的根细胞。

根的生长需要伸长区的延长和近端分生区的增殖。

胚胎发育后期细胞通过增殖和分化来维持近端分生区并控制根的总体伸长速率(Beemster and Baskin 1998)。

1.4 拟南芥花的发育调控
合适的成花诱导时间有利于高等植物成功繁衍后代，因此阐明植物花期调控的机制对作物增产具有启示性的意义（Sawa and Kay 2011）。

植物的生活史伴随着一系列的发育阶段的转变，这一过程受到外部环境信号和内部调节因子的控制。

成花诱导受到光周期，春化，赤霉素（GA），自主通路和衰老调控。

前三种途径主要针对环境因子做出调节反应；后两种途径主要对于植物的成花调控并不依赖于环境因素，而是受到植物内部
第一章文献综述 3
发育程序的控制（Kim et al. 2009；Mutasa-Göttgens and Hedden 2009；Srikanth and Schmid 2011；Wullschleger and Weston 2012）。

运用正向遗传学和反向遗传学的方法对拟南芥成花机制进行遗传剖析发掘出大量的调节植物开花的基因。

阐明这些途径是如何整合在一起为认识植物响应各种信号调控成花转变至关重要。

与此同时，调节途径的相互串联可以帮助说明多信号调控植物开花的协调机制，这些调节通路的差异性为植物成花调控提供了多样性。

上述调节路子最终汇聚整合到植物花分生区的基因诸如FRUITFUL (FUL),CAULIFLOWER (CAL), LEAFY (LFY), SEP ALLATA (SEP)的激活将会引起植物顶端转变形成花序分生组织。

此外此外在分生组织ABCDE基因的表达启动成花（Pose et al. 2012）。

以往的研究显示多条调节途径集成在一系列的开花途径整合子上，比如：FT, SOC1, CO,FLC。

这些花期基因又受到DNA的大量甲基化，组蛋白修饰，siRNA介导的染色质沉默和可变剪接机制的调控（Fornara and Coupland 2009；Sun et al. 2013；Zhou et al. 2013）。

随着模式植物系统中植物开花过程的研究不断深入，有助于帮助了解其他植物的发育转变所对应的分子活动。

有些一年生的植物在一年内完成生活周期，而多年生植物凭借每年新生的花芽大大延长了其繁殖年限。

尽管植物的生活史或长或短，植物的成花诱导以及花器官的形成所依赖的遗传调控机制是一致的。

因此在拟南芥开花机制的深入研究可以更好的帮助探讨在其他植物中的相似过程，并将研究成果运用到农作物的生产实践中，提高作物产量和品质。

过去几年来发掘了许多成花基因。

然而更为清楚的是遗传分析确立的调控通路并非完全独立的，大量的研究证据显示这些信号通路之间存在联系，调控信号最终整合在一起调控共同的下游基因。

例如，最新的研究表明在光周期和GA途径间存在彼此交叉，现在长、短日照条件下调控FT功能（Yu et al. 2012）。

春化和自主途径共同作用于FLC，FLC可以抑制叶片中FT的活性，说明FLC在春化和自主途径间建立了联系（Song et al. 2013）。

拟南芥开花行为可根据对春化需要分为过冬型（winter annual）和快速型（rapid cycling）两种。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）快速循环的品系中早开花的习性部分是由于自主成花促进途径（autonomous floral-promotion pathway，AP）的基因。

AP通过抑制成花抑制因子FLC（FLOWERING LOCUS C）的表达来促进开花。

因此，AP突变体由于FLC表达水平升高而延迟成花发育，并且这种晚开花表型可以在FLC的功能缺失突变中消除。

自然环境下的每年越冬的是晚花植物，但经过春化能够消除成花延迟。

这种晚开花春化反应型是由两个基因的相互作用产生的：FLC和FRI（FRIGIDA）。

FRI是一个能够激活FLC表达且生物化学功能未知的基因。

因此，在春化之前，FRI导致FLC以高水平表达，延迟了开花。

春化作用通过抑制在FLC基因座处的性组蛋白修饰介导的FLC的表观遗传学关闭，消除了FRI和FLC作用引起的晚期开花表型。

Col-0和L er两种生态型遗传背景与成花时间的差异有很好的研究。

L er的FLC等位基因在内含子I中含有反转录转座子，导致表达水平降低。

因此，FRI和AP突变在L er中比在Col-0中显示较弱的晚开花表型。

MiR172 和miR156家族受到低温的诱导，暗示年龄途径和温度
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调控的途径存在联系。

年龄途径和GA途径通过SPL和DELLA之间直接的物理互作的方式整合在一起，这种结合降低了SPL的转录活性（Jung et al. 2012）。

现如今我们对于植物开花的调控机制仅限于调控框架的构建，因此在开花研究领域未来的研究应关注相关基因的生化功能以及各个信号通路整合信息调控开花的作用方式。

这方面研究的下一阶段任务是将研究发现由模式植物转移到经济作物中，实现作物增产。

1.5 图位克隆
图位克隆(map-based cloning)是一种不断缩小定位区间接近突变位点的技术。

1986年剑桥大学的Alan Coulson在从事构建线虫（Caenorhabditis elegans）基因组物理图谱的研究中首次提出该项技术（Coulson et al. 1986）。

寻找与突变表型连锁的分子marker，缩小染色体区间（Jander et al. 2002）。

在过去几十年中，由于各种技术和方法的发展，正向遗传筛选的遗传图谱步骤已经发生了很大的变化。

在典型的情况下，分离到的具有感兴趣表型的突变体，并且使用明确的杂交方案产生含有突变表性和野生型个体的重组作图群体。

由于突变基因和附近遗传标记之间发生并不频繁的重组，这些遗传标记连锁的等位基因将与突变基因共分离，而未连锁的等位基因将在表型突变个体和野生型个体之间显示基本上随机的分离。

因此，甚至使用重组率分析基因区间。

基因检测分析可以检测来自突变背景的等位基因的这种大量集中分布，并且指导随后分析出具有突变基因的区域。

因此，甚至可以使用重组群体中的等位基因频率的分析将表型与基因组区域相关联。

这使得能够通过混合的DNA 池中的等位基因频率进行遗传作图，其通常被称为混合分离分析（BSA）或选择性DNA 池，并且大大简化了基因检测的劳动。

分子标记是染色体上一个位置已知的基因或者DNA序列，可以用于细胞，个体或者物种的鉴定。

当前被广泛应用于图位克隆实验的分子标记有基于简单序列长度多态性（SSLPs）（Bell and Ecker 1994），剪切扩增多态性（CAPs）（Konieczny and Ausubel 1993）和CAPs衍生出的dCAPS（Michaels and Amasino 1998）。

野生型Columbia(Col-0)全基因组测序的完成，不同分子标记的开发、各种图谱的相继建立，检测DNA多样性手段的飞速发展，大大缩短了时间。

图位克隆成为快速的发展的技术。

1.6 全基因组测序技术
虽然所有克隆的方法都很直接和快速的，但是它们的应用受到不同品系之间杂交后基于数量性状的筛选（例如遗传修饰剂的筛选）限制，阻碍了筛选的成功率。

主要障碍是不同品系杂交后的F2群体中相当大的突变表型受到削弱并具有了微妙的表型改变，影响了对突变体的识别。

此外，如果遗传筛选涉及预先存在的突变体的再突变，那么作图取决于在起初的突变在另一种品系中的可观测性，在这样的背景中突变的渐渗，或者
第一章文献综述 5
对于起初突变进行的鉴定。

面对这些缺点，Ashelford et al.已经证明，通过直接对完整的突变基因组进行重测序，鉴定EMS诱导突变的方法是可行的（Ashelford et al. 2011）。

然而，他们的方法最初鉴定出103个发生突变的基因，其中48个具有改变推定的蛋白质氨基酸序列的潜力。

此外，突变聚集在基因组的两个分离的区域中，即使突变体已经与亲本回交四次。

最近，Abe et al.通过将突变体同其非诱变前体回交来减少大量候选突变，然后对这些杂交分离群体的混合DNA进行测序（Abe et al. 2012）。

这大大减少了候选基因的数量，虽然不可能仅从测序数据确定突变位点。

存在的主要问题仍然是每个候选突变的短读覆盖率，其通常低于批量DNA内组合的个体的数量。

这仅仅基于全基因组测序数据阻碍了精确的等位基因频率估计，因此使得不可能区分突变基因和同突变基因紧密连锁的突变的关系。

在Hartwig et al.的研究中，结合等位基因群体分离分析与深度候选重测序（dCARE），以便于基于批量的DNA测序数据的突变识别（Hartwig et al. 2012）。

该方法依赖于假设在批量分离池中，在所有EMS诱变位点中导致该突变表型的位点的频率最高。

单独使用重测序数据，不可能区分EMS诱变的等位基因频率的微妙变化。

然而，使用新的Ion Torrent测序技术对所有候选突变进行深度重测序使得能够快速和有效地检测紧密连锁的突变之间的微小等位基因频率差异，从而鉴定出突变基因。

第二章拟南芥abs3-1D逆转突变体的筛选与基因克隆
实验室在前期工作中为研究植物生长发育的遗传调控，通过激活标签的方法筛选得到了一个发育异常的半显性突变体abs3-1D(abnormal shoot3-1 dominant)，abs3-1D比野生型(Col-0)植株叶柄短，株型小，更为紧凑，叶片颜色偏黄，开花时间明显提前，次生花序增多，主花序茎的生长受到抑制，出现变短的角果且种子的育性下降，表现出矮化丛生的表型（如图2-1，A）。

同时在黑暗诱导条件下abs3-1D较野生型衰老明显提前（如图2-1，B）。

为了进一步探究ABS3基因在参与植物生长发育过程中的调控作用，通过EMS化学诱变的方法建立了一个以abs3-1D突变体为遗传背景的拟南芥突变体库，通过对库中abs3-1D逆转突变体的研究来阐明突变基因的功能和在拟南芥发育中的作用，揭示ABS3与突变基因的相互作用模式，以期对拟南芥生长发育的遗传调控有进一步的了解。

图2-1. 野生型(Col-0)和abs3-1D
（A）持续光照条件下生长25天的野生型和abs3-1D。

（B）光下生长19天，黑暗处理6天后的野生型和abs3-1D。

Fig2-1. Phenotype of WT (Col-0) and abs3-1D
(A) 25-day-old WT(Col-0) and abs3-1D in constant light; (B) phenotypes of WT(Col-0) and abs3-1D in 6-day-dark after 19-day-light.
2.1 材料和方法
2.1.1
2.1.1.1 植物材料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0 (Columbia)和实验室前期对abs3-1D进行EMS诱变构建突变体库。

2.1.1.2 实验试剂
异丙醇，无水乙醇，Taq DNA聚合酶，10×Taq Buffer，dNTP Mixture
2.1.1.3 实验仪器
离心机（eppendorf 5424），PCR仪，涡旋振荡器
2.1.1.4使用溶液
(1)CTAB植物DNA提取液
Final Concentration500 mL Tris-HCl100 mM（pH 8.0） 6.06 g
EDTA-Na220 mM 3.72 g NaCl 1.4 M 40.9 g
CTAB 2 % 10 g
PVP40 1 % 5 g 先加水200mL，添加药品过夜混匀，Adjust pH to 8.0（浓HCl），定容至500 mL，121 °C高压灭菌20分钟，室温保存。

(2)酚氯仿
Final Concentration25 mL 平衡酚50 % 12.5 mL
氯仿49 % 12 mL
异戊醇 1 % 500 μL
涡旋震荡，4 °C冰箱保存。

2.1.2
2.1.2.1 生长条件
将种子点种在充分吸水的商业泥炭藓混合土壤（Pindstrup，Denmark）上，4 ºC黑暗处理3天，放置在22 ºC的持续光照的培养间生长，光照强度为100 μmol·m-2·s-2，湿度70 %。

2.1.2.1 突变体的筛选
大规模种植突变体库中的种子，每个盘子有35个pot，每个pot种植16颗种子，种植4盘植物。

待植物发芽后，观察具有特殊表型的植物，如叶色突变，叶形突变，表皮毛发育异常突变和晚花突变体等。

或者可以逆转abs3-1D突变的表型。

2.1.2.2 突变体的命名
以abs3-1D作为背景筛选，其原始突变即为“SuperF”突变体的编号格式是“原始突变+诱变群体编号-突变体编号”，如F08-69表示从SuperF第8个诱变群体中筛选出的编号为“69”的突变体。

2.1.2.3 技术路线
图2-2. 技术路线图
Fig2-2. Technical schematic diagram
2.1.2.4 CTAB法提取DNA
a)用镊子夹取拟南芥鲜嫩的叶片2-3片于1.5 ml离心管中，至于液氮中冷冻片刻，稍
后使用小木棒进行研磨成粉；
b)向离心管中加入CTAB溶液550 μL，置于水浴锅中10 min，取出室温静置10 min；
c)加入酚氯仿500 μL，涡旋振荡充分后，室温离心12000 rpm，5 min；
d)吸取上一步离心所得上清到新标记的离心管中，加入氯仿500 μL，进行涡旋振荡，
然后离心12000 rpm，5 min；
e)离心后吸取上清于新的离心管里，加入310 μL异丙醇（-20 ºC冷藏），上下颠倒混
匀，放置到-20 ºC醇沉10 min；
f)取出后离心14000 rpm，10 min，倒掉上清液，加入500 μL乙醇（-20 ºC冷藏），上
下颠倒混匀，离心14000 rpm，2 min；
g)倒掉上清液，打开离心管盖子，室温静置10 min，将乙醇挥发干净；
h)加入100 μL溶液TE，离心14000 rpm，1 min，放到4 ºC冰箱，过夜后PCR。

2.1.2.5 T-DNA鉴定
总体系20 μL：10×Taq Buffer 2 μL，dNTP Mixture (2 mM) 2 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL，DNA模板1 μL，正反向引物（10 μM）各加0.4 μL，ddH2O补足至20 μL。

PCR 反应条件：94 ºC预变性2 min；94 ºC变性30 s，退火30 s（温度随引物而异），72 ºC延伸30 s，40个循环；72 ºC补延伸5 min。

0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

引物见（表2-1）。

表2-1 T-DNA鉴定所用引物序列
Table 2-1 Primer sequence for T-DNA insert identitation
引物名称(Prime Name)序列(Sequence)
SuperF F CTTAGCTAGTCATAGTGGAG
SuperF R ATACCAACACTGTTAGCTCG
LB0ATTTGGACGTGAATGTAGACAC
2.1.2.6 TianGen试剂盒（DNAquick Plant System）提取DNA
a)取植物新鲜组织（约200 mg），液氮冷冻研磨；
b)加入400 μL buffer FP1，6 μL Rnase，涡旋振荡1 min，室温10 min；
c)加入130 μL FP2，涡旋1min，12000 rpm×5 min；
d)吸上清再次离心；
e)加入0.7倍体积的异丙醇，12000 rpm，2分钟，析出沉淀；
f)加入600 μL 70 %乙醇，涡旋5分钟，离心12000 rpm×2 min；
g)重复步骤f；
h)室温凉置；
i)加入TE，65 ºC，10-60 min，溶解DNA。

2.2 结果与分析
2.2.1 abs3-1D
实验室前期工作中通过EMS化学诱变的方法建立了一个以abs3-1D突变体为遗传背景的拟南芥突变体库，通过大规模的种植筛选，发现一株能够逆转abs3-1D突变体早花表型的突变体，将该双突变体命名为F08-69，而且与野生型相比，F08-69突变体同样表现出晚花的表型（图2-3，A）。

F08-69同诱变前的亲本abs3-1D回交，发现F08-69中逆转基因为单基因隐性突变。

将F08-69与野生型(Col-0)杂交对F2代中分离出的晚花突变体进行T-DNA插入鉴定，结果显示F2代晚花突变体中除了已知的T-DNA插入纯合的F08-69突变体，分离出不含T-DNA插入的晚花突变体（如图2-3，B），将其命名为
F08-69single。

双突变体F08-69作为abs3-1D表型的逆转突变体，与abs3-1D突变体相比，其主花序茎抽薹时间晚于abs3-1D，但提前于F08-69single。

如前所述黑暗条件下abs3-1D衰老加速，因此我们对F08-69single黑暗诱导条件下的衰老表型进行研究。

将在持续光照条件下生长19天的Col-0，abs3-1D，F08-69和F08-69single进行黑暗处理，6天后观察表型。

对照组为25天持续光照条件下生长的植株（图2-4，A）。

实验组野生型(Col-0)第一对真叶和第三对真叶的叶片出现了部分黄化，abs3-1D植株整体黄化，相对于野生型(Col-0)表现出衰老加速的特征，而F08-69仅第一对真叶表现出明显的黄化，F08-69single并未表现出明显的衰老迹象（图2-4，B）。

上述结果说明F08-69single的突变表型成功的逆转了abs3-1D黑暗诱导条件下叶片衰老的提前，说明ABS3与该突变基因存在某种相互作用共同调控植物的生长发育。

此外F08-69生长发育前期与野生型(Col-0)表型并无明显差异，当野生型植株转入生殖生长阶段时，F08-69开始出现叶片颜色变紫，花青素累积的现象，随着植株的生长发育，新生叶片的表皮毛分支出现一定比例的二分支，这与野生型植株的表皮毛分支差异很大。

图2-3. 晚花突变体F08-69
(A)光下生长33天的Col-0，abs3-1D，F08-69，F08-69single；(B)T-DNA鉴定
Fig2-3. Late flower mutant F08-69
(A) Phenotypes of representative 33-day-old wild-type (Clo-0) and F09-03. (B)T-DNA identification.。