实验四 粗糙链孢霉顺序四分子分析 一、目的 1 了解粗糙链孢霉的生活

实验四粗糙链孢霉顺序四分子分析
一、目的
1. 了解粗糙链孢霉的生活周期及特性。

2. 通过对粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，了解顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。

二、原理
粗糙链孢霉（Neurospora crassa）属于真菌中的子囊菌纲。

它是进行顺序四分子分析的好材料。

粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。

由菌丝顶端断裂形成分生孢子。

分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分子孢子中含有几个核。

分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这样形成粗糙链孢霉的无性生殖过程。

粗糙链孢霉除无性生殖过程外，也可以进行有性生殖。

粗糙链孢霉的菌株具有两种不同的接合型（mating type），用A, a或mt+, mt-表示。

接合型是由一对等位基因控制的，并符合孟德尔分离定律。

没接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，有性孢子可很快进入减数分裂。

有性生殖过程有两种方式：
1. 当菌丝在有性生殖的杂交培养基上增殖时，就会产生原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。

进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。

钩状细胞顶端细胞的两核形态合子，合子核再进行减数分裂，分为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成8个核，顺序地排列在一个子囊中。

原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子中果。

一个子囊果中有30～40个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30～40μm，比3～5μm的分生孢子要大得多。

子囊孢子如经60℃处理30～60分钟，便会发芽，长出菌丝，进入无性繁殖。

2. 不同接合型的菌丝相接触，两核配对，但不融合，形成形成双核体，随着双核体菌丝的发育，子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊，即子囊进行发育。

在这些尚未成熟的子囊中即含有融合以后形成的二倍体合子。

合子形成以后就很快在发育着的子囊中进行减数分裂，形成4个减数孢子，再进行一次有丝分裂，形成8个单倍体的子囊孢子。

而整个子囊壳就成为成熟的子囊果（图8-1）。

粗糙链孢霉的子囊孢子是单倍体细胞，由它萌发长出的菌丝亦是单倍体，即它们是减数分裂的产物。

所以一对等位基因决定的性状在杂交子代中就可以看到分离。

在粗糙链孢霉中，一次减数分裂产物包含在一个子囊中，所以从一个子囊中的子囊孢子的性状特征就很容易直观地看到一次减数分裂所产生的四分体中一对等位基因的分离。

而且8个子囊孢子是顺序地排列在狭长形的子囊中，根据这一特征可以进行着丝粒作图，并发现基因转换（geneconversion）。

如果两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么杂交所形成的每一子囊，必定有4个子囊孢子属于一种类型，4个子囊孢子属于另一种类型，其分离比为1：1且子囊孢子按一定顺序排列。

如果这一对等位基因与子中孢子的颜色或形状有关，那么在显微镜下可以直接观察到子囊孢子的不同排列方式。

本实验有赖氨酸缺陷型（Lys-）与野生型（Lys+）杂交，得到了子囊孢子分离为4个黑色的（+）和4个灰色的（-）。

黑色孢子是野生型；而赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，在野生型孢子成熟变黑时，还未变黑，而呈浅灰色。

根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，
可知合子在减数分裂时，基因Lys-和着丝粒之间发生交换的情况，最终可有两大类型的子囊出现，即第一次分裂分离子囊和第二次分裂分离子囊（图8-2）。

从图8-2可以明显看出，第二次分裂分离子囊的出现，是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果。

即凡由第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，而由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊。

第二次分裂分离的子囊越多，则有关基因和着丝粒之间的距离越远。

所以由第二次分裂分离子囊的频度可以计算某一基因和着丝粒之间的距离，称之为着丝粒距离。

由于交换仅发生在二价体的四条染色单体中的两条之间，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此可据下列公式求出着丝粒与有关基因之间的理组值或图距：
有关基因与着丝粒之间的重组值=交换型子囊数（1/2）/交换型子囊数+非交换型子囊数×100%
三、实验材料
1. 粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+，接合型A，分生孢子呈粉红色。

2. 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-，接合型a，分生孢子呈白色。

四、器具和试剂
显微镜、镊子、酒精灯、接种针、滤纸、载玻片、试管、培养皿、解剖针。

基本培养基、补充培养基、完全培养基、杂交培养基（以上培养基配方见本实验附录，供选用）、5%次氯酸钠（NaClO）、5%石碳酸。

五、实验步骤
1. 菌种活化：菌种平时在4℃～5℃保存，使用前要先进行活化，以让菌种生长状态良好。

只需将菌种分别接在完全培养基试管斜面上，28℃温箱培养5天左右，至菌丝的上部有分生孢子产生。

有时，赖氨酸缺陷型在完全培养基上也长不好，需适量添加赖氨酸。

2. 杂交接种：将亲本菌株接种在同一杂交培养基上。

具体操作可采用下述方法。

（1）先接缺陷型，后野生型，一次在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝。

然后在培养基上放入一灭菌的折叠滤纸，贴上标签，注明亲本及杂交日期。

放入25℃温箱进行混合培养。

5～7天后就能看到许多棕色原子囊果出现，随后逐渐发育成熟，变大变黑，约14天左右，就可在显微镜下观察。

（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5～7天后即有原子囊果出现。

同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，用无菌水中配成近于白色的悬浊液，将此悬浊液加到形成原子囊果的培养表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5mol），继续在25℃培养。

原子囊果在加进分生孢子1天后即可开始增大变黑成子囊果，7天后即可成熟。

3. 压片观察：在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分子生孢子飞扬。

取一载玻片，滴1～2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附于子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜低倍镜（10×16）下观察，即可见一个果中会散出30～40个子囊。

象一串香蕉一样。

可加一滴水或次氯酸钠，用解剖针把子囊拨开。

此过程不需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出，致使不能分辨子囊类型。

观察过的载玻片，用过的镊子和解剖针等物都需放入5%石炭酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。

六、实验结果
1. 观察一定数目的子囊果，记录每个杂交型完整子囊的类型，并计算出Lys基因的着
丝粒距离。

（1）赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟变黑时，缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。

如果观察时间选择不当就不能观察到好的结果。

过早都未成熟，全为灰色；过迟都成熟了，全为黑色，都不能分清子囊类型。

所以最好在子囊果发育至成熟大小，子囊壳开始变黑时，每日取几个子囊果压片观察，到合适时期置于4℃～5℃冰箱条件下，保证在3～4周内观察都行。

（2）有时会观察到下表所示的子囊类型
有丝分裂时纺缍体的重叠造成的第4、第5孢子的位置互换。

其它类型则是由基因转换（gene conversion）造成的。

附：粗糙链孢霉培养基
（1）基本培养基
柠檬酸·2H2O(Na3C6H5O7·2H2O) 3.0g
KH2PO4 5.0g
NH4NO3 2.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
CaCl2·2H2O 0.1g
微量元素溶液（见（3）） 1.0ml
生物素溶液（10 g/ml） 1.0ml
蔗糖20.0g
琼脂15.0g
加蒸馏水至1000ml
(2)杂交培养基
KNO3 1.0g
KH2PO4 1.0g
MgSO4·7H2O 0.5g
NaCl 0.1g
CaCl2·2H2O 0.1g
微量元素溶液（见（3）） 1.0ml
生物素溶液（10 g/ml） 1.0ml
蔗糖20.0g
琼脂15.0g
加蒸馏水至1000ml
（3）微量元素溶液（基本培养基和杂交培养基用）
柠檬酸·H2O 500mg
ZnSO4·7H2O 500mg
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 100mg
CuSO4·5H2O 25mg
MnSO4·4H2O 5mg
H3BO35mg
Na2MoO4·2H2O 5mg
加蒸馏水至100ml
（4）补充培养基
在基本培养基上补一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。

氨基酸用量一般是100ml基本培养基中加5～10mg。

本实验所用补充培养基只要在基本培养基中适量的赖氨酸，赖氨酸缺陷型菌株就能生长。

（5）完全培养基
基本培养基1000ml
酵母膏5g
麦芽汁（亦可省）5g
酶解酪素1g
维生素混合液
硫胺素100mg
核黄素5mg
吡哆醇5mg
泛酸钙50mg
对-氨基苯甲酸5mg
菸酰胺5mg
胆碱100mg
肌醇100mg
叶酸1mg
蒸馏水1000ml
蔗糖20g
（为获大量分生孢子，可用1%的甘油代替蔗糖）。

加2%琼脂，即为固体完全培养基。

（6）马铃薯培养基
将马铃薯洗净去皮，切碎，取200g,加水1000ml，煮热，然后纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2%琼脂，20g蔗糖，煮融，分装到试管中。

亦可将马铃薯切成黄豆大小碎块，每支试管放4～5块，再加入融入化好的琼脂，蔗糖。

上述培养基分装试管后，55.2kPa（8磅）灭菌30分钟，取出摆成斜面，可代替完全培养基使用。

（7）玉米杂交培养基
将玉米浸泡软化，破碎，每管3～4粒，加入少量琼脂（0.1g左右），加棉塞消毒，即成，不需碎面。