1湖南师范大学生命科学学院本科学生2002年以来发表论文...

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1．湖南师范大学生命科学学院本科学生2002年以来发表论文和获奖情况2．湖南师范大学生命科学学院本科学生研究创新性实验优秀论文（报告）选编
1．湖南师范大学生命科学学院本科学生2002年以来发表论文和获奖情况（1）．发表的论文
（2）获奖情况
2．湖南师范大学生命科学学院本科学生研究创新性实验优秀论文（报告）选编
副溶血弧菌中一具Mg2+转运功能的MgtE基因的分子克隆
与功能鉴定
学院：湖南师范大学生命科学学院
学生姓名：于峰学号：N41030204 专业：生物技术班级 2003-2
学生姓名：姚力群学号：N41030206 专业：生物技术班级 2003-2
学生姓名：李晴波学号：N41030136 专业：生物技术班级 2003-1
指导老师：李东屏副教授
摘要：MgtE基因家族是最初在细菌中发现的一类具有Mg2+转运能力的基因家族。

基因组数据库搜索显示副溶血弧菌（Vibrio parahaaemolyticus RIMD 2210633，VP）中存在一MgtE基因家族成员。

我们克隆了该基因并将之命名为VP- MgtE。

并利用沙门氏杆菌突变株MM281作为宿主菌进行了功能互补实验。

此外,该基因的表达也提高了该菌株对铝毒害的抗性。

同时我们运用定点突变的方法研究了VP- MgtE中的保守氨基酸残基对其功能的影响。

关键词: VP- MgtE ; Mg2+转运体; 副溶血弧菌; 定点突变；铝毒害
Molecular Cloning and Characterization of the VP-MgtE, a Putative Mg2+ Transporter from Vibrio parahaaemolyticus
Yu Feng Liqun Yao Qingbo Li
（College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha 410081,Hunan,China）
Abstract: MgtE gene family, which was first found in bacteria, has the ability to take up Mg2+. Genomic sequence data indicated the presence of MgtE homolog in the gram-negative bacterial Vibrio parahaaemolyticus. We cloned and named it as VP-MgtE. The study showed that VP-MgtE could functionally complemented a salmonella mutant MM281 which lacks in Mg2+uptake capability. MM281 mutant transformed with VP-MgtE showed resistance to aluminum ion. Site-directed mutagenesis by overlap extension by PCR was used to study the roles of the key amino acid residues of the protein.
Key word: VP-MgtE, Magnesium Transporter, Vibrio parahaaemolyticus, Site-directed mutagenesis, Aluminum ion toxicity
1. 引言
Mg2+是生活细胞中含量最丰富的二价金属离子,其在一系列酶促反应中作为辅因子起作用。

缺失足够的Mg2+,核糖体亚单位将会分离,同时细胞膜也会变成松弛渗漏的状态。

离子状态的镁调节许多重要的酶促代谢,还可通过特定的金属结合位点在膜蛋白通道中起作用[1]。

Mg2+具有独特的化学特性, Mg2+具有最大的水合半径,最小的离子半径和最高的电荷密度。

其水合半径是其离子半径的400倍。

而同为丰富金属离子的Ca2+和Na+的相应半径比却
只有25倍,K+的相应半径比最小,仅4倍。

由于细胞膜给离子的进出细胞形成了一道屏障。

故离子进出细胞必须通过膜上特定的转运蛋白来实现。

一般认为转运蛋白可分为离子通道和载体蛋白两大类。

载体蛋白转运底物时是与其它物质偶联进行的，具有和酶一样的底物饱和性，编码载体蛋白的基因的表达也常常受到外界底物浓度的影响，一般是在低底物浓度时，其基因的表达水平会提高。

由于Mg2+独特的几何特性和化学特性,有人猜测其转运系统也具独特性，细菌中的研究支持该假说[2]。

目前,整个生物界中已发现有五大Mg2+转运家族:CorA家族,Mg2+/H+交换体,离子通道,P型磷酸酶和MgtE基因家族[3]。

主要的Mg2+转运家族是细菌中的CorA家族,蛋白拓扑分析显示其具有独特结构：N端有一个大的，酸性的周质区，C端有2个疏水的跨膜区，有很强的螺旋性。

CorA序列上存在保守基序GMN，是其转运Mg2+所必需的，若GMN基序中有一个氨基酸突变，其转运能力就会丧失[14]。

最近,Li等人利用功能克隆策略在拟南芥中发现了一与CorA基因结构类似的基因家族[4]。

表明CorA基因广泛分布于自然界中。

ALR1和ALR2是在酵母中发现的一类CorA基因，在酵母中过量表达ALR蛋白可提高其对铝毒害的抗性[15]。

MgtA/B是S.typhimurium中发现的另外两个具Mg2+转运能力的基因，两个都是大的复合跨膜蛋白，属于P型磷酸酶家族。

它们的表达受到低浓度Mg2+的诱导[5]。

MgtE基因家族首先在Bacillus firmus OF4中被Ronald等人在寻找新的CorA基因时发现。

目前一般认为其具有五个跨膜区。

其跨膜区的分布和CorA具相似性，都主要分布于C端，其N端位于胞质区。

MgtE和CorA两基因家族在转运离子的类别上也具有部分相似性。

MgtE的突变株和CorA一样可增强对Co2+的抗性。

MgtE可功能互补缺失CorA, MgtA, MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株MM281[5],使其可在低浓度Mg2+浓度(<10mM)下生长。

同时MgtE 也具有Co2+, Cd2+, Mn2+等二价金属离子的转运能力。

多序列比对表明其第二和第五个跨膜区较保守[6,7]。

基因组序列搜索显示MgtE家族在古细菌，原核生物和真核生物中都有分布，但其分布的广泛性不如CorA家族。

目前对MgtE基因家族转运Mg2+ 的分子机制还了解甚少。

为了更进一步了解MgtE基因家族转运Mg2+的分子机制，我们从副溶血弧菌中克隆了一MgtE 基因,将之称为VP-MgtE，并对其进行了功能鉴定和定点突变等实验。

2. 材料和方法
2．1. 菌株的生长条件
E．coli DH5α在37℃，LB培养基中生长, 必要时添加相应抗生素。

副溶血弧菌于37℃LB中培养。

S.typhimurium MM281需要高浓度Mg2+才可以生长,它被用于功能互补实验, 于37℃，Mg2+(以MgSO4的形式添加)终浓度为100 mM,氯霉素浓度为34 μg/ml的LB 或
N-minimal培养基中生长。

2．2. 载体，酶类及各种试剂盒
pMD18-T 载体和实验中用到的所有酶类均购自大连宝生物工程有限公司。

质粒纯化及胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司。

pTrc-99A由本室保存。

2．3. VP-MgtE基因的克隆及载体构建
VP基因组DNA按照Robert K Flamn[8]的方法提取。

根据VP-MgtE基因序列用Primer Premier5.0设计一对引物,并添加酶切位点SacⅠ和KpnⅠ。

正向引物为(TATGAGCTCGAACGAA TGGCAG(SacⅠ)反向引物为(ATAGGTACCACTGGCTTAGATCAGC （KpnⅠ）)。

用高保真酶Pyrobest DNA polymerase 进行PCR扩增。

回收目的片段,连接到pMD18-T载体上,再用SacⅠ和KpnⅠ酶切,定向克隆至表达载体pTrc99A,并酶切鉴定阳性克
隆。

2．4. 生物信息学分析的主要软件及数据库
基因序列数据由NCBI中获得。

跨膜区分析软件为TMHMM,多序列比对软件为ClustalW, 常规的核酸蛋白分析软件利用DNAMAN进行。

2．5. MM281的功能互补和铝离子毒害实验
将pTrc99A-VP-MgtE质粒电击转化进入MM281。

鉴定阳性克隆，分别挑取MM281-VP-MgtE,MM281-pTrc, MM281单菌落在试管中过夜培养。

然后再按50:1 (50mL LB:1mL菌液)的比例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养。

同时测OD600值。

当OD600达到0.6～0.7之间时,加入1 mM/L的IPTG进行诱导, 当OD600到达1.0时取出,取菌液100 μl 加入900 μl水中。

分别稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。

取稀释的菌液2 μl点样于不同Mg2+浓度的互补平板上, Al3+（以AlCl3的形式添加）毒害中点样于pH5, Mg2+浓度为100 mM 的LB固体培养基上。

37℃倒置培养两天后观察菌落生长情况并拍照。

2．6. 液体生长曲线
挑取MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-pTrc的单菌落在含相应抗生素的LB中摇菌,当OD600=0.6～0.8时,1200 rpm离心收集细胞,用去离子水清洗两遍,以除去残留的Mg2+,然后用去离子悬浮。

准备7种不同浓度(0, 50 µM,100 µM,500 µM,1 mM, 5 mM, 10 mM)和相应抗生素的N-minimal培养基,将上述准备好的培养物（起始OD600=0.001～0.002）加入N-minimal培养基中。

37℃摇菌,每两小时测OD600一次并记录数据。

共测24 h。

2．7. 离子敏感性实验
按功能互补实验过程一样准备好菌液，然后点至不同浓度的金属离子板上。

37℃倒置培养2 d后观察其生长情况并拍照。

2.8. 定点突变
定点突变的方法按照分子克隆上介绍的重叠延伸诱变的方法分别设计两对引物。

从野生型VP- MgtE-pTrc99A中用高保真酶Pyrobest DNA polymerase 进行三次PCR。

再SacⅠ，Kpn Ⅰ双酶切，定向构建至pTrc-99A上产生特异位点的突变。

突变引物设计见表1。

再按照2.5的方法进行功能互补实验。

表1 突变氨基酸，引物及克隆位点和侧翼引物:
PrimerA,5’-AGGAAACAGACCA TGGAATTCGAG-3’;
primer B,5’-CAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTT-3’.
名字突变碱基突变氨基酸突变正向引物突变反向引物侧翼引物克隆位点（位置）
Vp-J1 953 Ala to Gly 5’AAATGGCGGGAATT 5’AAGACCGCAATTCC A/B SacI,KpnI （320）GCGGTCT3’CGCCATT3’
Vp-J2 992 Gly to Ala 5’CA TCCATGGGTGCT 5’GTTACCTGCAACAG A/B SacI,KpnI （331）GTTGCAGGTAA-3’CACCCATGGA3’
Vp-J3 1265 Aps to Ala 5’AGATGAA TA TCGCT 5’CAGCAAGGGCAGG A/B SacI,KpnI （422）CCTGCCCTTG-3’AGCGATA TTCA3’
Vp-J4 1267 Pro to Ala 5’AGA TGAA TA TCGAT 5’CAGCAAGGGCAGC A/B SacI,KpnI （423）GCTGCCCTTG3’ATCGATA TTCA3’
Vp-J5 51307 Asp to Ala 5’TGTGATTGGCTCGT 5’AGGAAAACAGACG A/B SacI,KpnI （436）CTGTTTTCCT3’AGCCAATCACA3’
Vp-J6 1316 Gly to Ala 5’GACTGTCACTGCTG 5’GACAAGCCAATCAC A/B SaI,KpnI （439）TGATTGGCTT3’AGCAGTGACA3’
Vp-J7 1319 Leu to Ser 5’TGTGATTGCCTTGT 5’AGGAAAACAGACAAA A/B SacI,KpnI （440）CTGTTTTCCT3’GGCAA TCACA3’
3．结果与讨论
3．1. VP-MgtE与MgtE基因家族其它成员相比显示部分序列相似性
VP-MgtE的编码一个含451个氨基酸的蛋白质。

跨膜分析显示其具有五个跨膜区。

其与Bacillus firmus OF4和Providencia stuartii中的MgtE序列分别具有21.15%,14.69%的相似性。

多序列比对表明它们在第二和第五个跨膜区具有较高的相似性。

结果见图1。

图1 VP-MgtE和MgtE家族其它成员运用ClustalW的比对结果。

红色方框表示突变后对其功能影响很大者，蓝色表示对其功能影响较少者，绿色表示无影响。

图中标出的五个跨膜区（TM1-TM5）为根据VP-MgtE的蛋白拓扑结构预测所得到。

比对中其它基因GenBank登陆号分别为 B.firmus：U18744; P.stuartii:U23806;
Human;NM_173854.
3．2. VP-MgtE可功能互补MM281的生长
MM281是一类丧失了CorA, MgtA, MgtB Mg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株。

它只能在高浓度Mg2+(>100 mM)下达到最佳生长速度。

结合功能互补的方法，它可作为一个研究Mg2+转运的很好的系统。

表达了VP-MgtE的MM281重组菌株可在低浓度Mg2+情况下生长, 甚至在不加Mg2+的LB培养基上生长。

而其阴性对照MM281, pTrc99A-MM281则只能在大于10 mM的N-minimal培养基上生长。

（见图2）。

结果可以说明VP-MgtE的表达互补了MM281在Mg2+转运上的功能缺失，使之重新具有了Mg2+转运能力。

从而使其可在含低浓度（<10mM）Mg2+的培养基中生长。

生长曲线结果也再次证明了目的基因的转运能力。

由图3(A)和图3(B)可知,表达了目的基因的MM281转化子可在100 µM的N-minimal培养基中生长。

而阴性对照只能在10 mM的培养基中生长。

图2 MM281。

MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在添加了不同Mg2+浓度的N-minimal互补平板上的生长结果.
3．3. VP-MgtE的表达改变了MM281的离子敏感性
已有研究显示,当细菌中积累一定量的重金属离子(如Co2+, Cd2+, Mn2+, Zn2+ )时，就会对细菌本身产生毒害作用并使之死亡。

由图4可知,表达了VP-MgtE基因的转化子增加了对Ni2+，Co2+ , Mn2+, Cu2+的敏感性,当Ni2+ ，Co2+ , Mn2+, Cu2+离子浓度达到500 µM, 500 µM, 500 µM, 1 mM 时,表达了目的基因的菌株就会死亡，我们可以认为VP-MgtE有Co2+, Cd2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+ , Cu2+离子的转运能力。

我们也做了Ca2+的实验,但没有发现差别。

图3-A MM281, MM281-pTrc, MM281-VP-MgtE 在10 mM Mg2+ 的N-minimal培养基中的生长结果。

实验结
果为三次不同时间下结果的平均值。

MM281（实心圆），pTrc（空心圆），VP-MgtE（实心三角）
图3-B MM281,MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE 在100 µM Mg2+。

的N-minimal培养基中的生长结果。

实验结果为3次不同时间下结果的平均值。

MM281（实心圆），pTrc（空心圆），VP-MgtE（实心三角）
3. 4. VP-MgtE的表达提高了MM281对铝毒害的抗性。

研究表明当pH<6时铝离子就可从结合态释放出来产生毒害作用[16]。

我们在pH=5时研究了VP-MgtE的铝抗性，我们发现VP-MgtE的表达可提高MM281对铝毒害的抗性。

结果见图5。

同时，为了证实确实是Al3+而不是Cl-在起毒害作用，我们也做了KCl的实验,与对照相比，我们没有发现区别（数据未列出）。

图4 MM281, MM281-pTrc, MM281-VP-MgtE 在含有不同金属离子浓度的N-minimal固体培养基上的生长结果。

3．5．定点突变改变了VP-MgtE的Mg2+转运能力。

我们运用定点突变的方法对VP-MgtE蛋白中的7个氨基酸进行了突变，由图6可以发现，VP-J1，VP-J2，VP-J5，VP-J6的突变使目的蛋白的Mg2+转运能力有很大的降底，VP-J4的转运能力和目的蛋白相比，有轻微的降底，VP-J3，VP-J7出乎我们意外，在10µM情况下和目的蛋白相比这两个突变株的转运能力竟然提高了。

这些突变都集中在第2和第5跨膜区。

在这两个跨膜区的每个突变对其转运能力都有影响，这也说明了这两个跨膜区在Mg2+装运中
的重要性。

3．6. 讨论:
副溶血弧菌是于1950年在日本的一次爆发性食物中毒中分离发现的。

该菌存在于近海的海水，海底沉积物和鱼类，贝壳等海产品中间。

是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。

我们从副溶血弧菌中克隆了一具Mg2+转运能力的MgtE基因家族成员：VP-MgtE。

并对其进行了功能的初步研究。

图5 MM281, MM281-pTrc, MM281-VP-MgtE 在含不同铝离子浓度的LB平板上的互补结果。

LB固体培养基pH=5, Mg2+离子浓度为100mM。

序列分析显示VP-MgtE的蛋白序列与目前已知的MgtE家族成员显示了部分相似性，多序列比对表明，它们在第2和第5个跨膜区和其它成员有较高的相似性。

在一些特定的保守基序中MgtE家族成员具有完全的相似性，如第5个跨膜区的DP基序。

最近，Angela Goytain 等人从人类中克隆了一Mg2+转运基因：SLC41A1，它具有10个预测的跨膜区，该基因的表达可受Mg2+浓度的影响，在低浓度Mg2+下表达会上升[9]。

序列分析表明它有两个大的跨膜片段和细菌中的MgtE家族的第2和第5跨膜序列具有较高的相似性，在第5个跨膜区保守性最高，我们运用定点突变的方法研究了这些保守区域，结果和我们预测中一样，当我们把这两个跨膜区中的一些保守氨基酸突变以后，它的镁离子转运能力和野生型相比有明显下降，甚至是完全丧失。

同时我们还从不同的菌种克隆了3个MgtE家族成员并进行了功能鉴定(结果未列出)，它们在这些保守的基序中也是完全一致的，所以我们推测这些保守的氨基酸是MgtE 家族发挥Mg2+转运功能所必需的。

图6 定点突变结果。

图中WT表示未进行突变的VP-MgtE，其他标示代表的突变位点见表1。

数据库搜索显示在古细菌（如Uncultured Methanogenic archaeon RC-1）和真核生物（如锥虫，鸡，人）中都有发现，我们推测MgtE和CorA家族一样也是一个广泛存在的基因家族，我们在植物和真菌中没有发现该基因家族成员，但我们不能说它在这些生物中就不存在，可能只是因为MgtE家族序列相互间相似性较低在数据库的搜索中才比较难于发现。

SLC41A1在其它二价离子的转运上和细菌中的MgtE有所不同，甚至MgtE各个成员间转运其它二价离子也是有差别的，我们认为这些基因在转运底物上的多样性主要是由这些基因在其它部位序列的多样性造成的。

最近，Mao等发现拟南芥中的A TMGT7转运Mg2+是受到pH值的影响的[10]，我们也进行了类似的实验，实验结果表明VP-MgtE转运Mg2+不受pH值的影响。

同时我们在实验中还发现VP-MgtE在高浓度的Mg2+下的生长反而不如在低浓度的情况下生长的快（数据未列出），因此我们猜测VP-MgtE可能为一类高亲和性,转运镁离子的载体蛋白，为了确定其与何种离子偶联进行Mg2+的转运，我们进行了钠和氯离子做为偶联剂的实验，但与对照相比我们没有发现区别。

我们也运用半定量PCR的方法研究了该基因在低Mg2+浓度的情况下该基因的表达变化，我们发现该基因的表达不受Mg2+浓度的影响（结果未列出）。

同时，Susana Merino等人发现，Aeromonas hydrophila 菌株中MgtE基因的突变可影响其游动能力和生物膜的形成[11]。

我们在前面已经提到，Mg2+对细胞膜的维持和稳定具有很大的作用，所以可以认为，正是MgtE的缺失而影响了其细胞内Mg2+的积累从而最终影响了其细胞膜的结构。

这给MgtE基因家族的Mg2+转运能力提供了新的证据。

土壤酸化是影响全球农业收成的一个重大因素。

其中土壤酸化最重要的一个方面就是铝毒害的产生，因为铝是地表含量最丰富的元素，在pH>6的情况下，铝主要是以各种结合态的形式存在，不产生毒害作用，但一旦pH<6铝就以离子的形式释放出来，对农作物和其他各种生物产生毒害作用[16]，目前对生物特别是植物抵抗铝毒害的分子机制还知之甚少，我们的研究为更好的理解生物抗铝毒害的分子机制提供了新的证据。

Li 等人通过同位素示踪实验发现Al3+可以抑制CorA家族基因A TMGT1的Mg2+转运[4]，这说明这可能就是Al3+产生毒害作用的一个靶标。

正是Al3+抑制了生物对Mg2+离子的吸收，从而影响了生物的正常生理活动而产生了毒害作用。

人们也早就观察到在铝毒害存在的情况下，植物有缺镁的生理现象[16]。

这也从一个方面证实了铝毒害产生的分子机制。

总之，我们从副溶血弧菌中克隆了一Mg2+转运基因并对其进行了功能的初步研究。

进一步的研究可集中于VP-MgtE转运Mg2+的直接证据，如原子吸收分光光度实验，同位素示踪实验。

及其转运Mg2+是否是离子偶联的，又与何种离子偶联。

从而为更好地理解MgtE家族转运Mg2+的分子机制提供新的信息。

参考文献（References）：
[1] Smith, RL., and Maguire, ME.1998. Microbial magnesium transport: Unusual transporters
searching for identity. Mol. Microbiol. 28, 217–226.
[2] Gibson,M.M.,Bagga,and Maguire,M.E.1991. Magnesium transport in Salmonella yphimurium:
The influence of new mutation conferring Co2+resistance on the CorA Mg2+transporter system.Mol.Microbiol. 5: 2753–2762.
[3] Richard C Gardner.2003. Genes for magnesium transport. Current Opinion: 263-267.
[4] Li L, Ana FT, Revel SM, Richard CG, and Luan S. 2001. A Novel Family of Magnesium
Transport Genes in Arabidopsis. The Plant Cell, 13: 2761–2775.
[5] Maguire ME. 1992. MgtA and MgtB: Prokaryotic P-type ATPases that mediate Mg2+ influx. J.
Bioenerg. Biomembr 24: 319–328.
[6] Smith RL, Thompson LJ, Maguire ME.1995. Cloning andcharacterization of MgtE, a putative
new class of Mg2ttransporter from Bacillus firmus OF4. J Bacteriol 177: 1233-1238.
[7] Townsend DE, Esenwine AJ, George J 3rd, Bross D, Maguire ME, Smith RL.1995. Cloning of
the mgtE Mg2+ transporter from Providencia stuartii and the distribution of mgtE in gram-negative and gram-positive bacteria. J Bacteriol. 177: 5350-5354.
[8] Flamm RK, Hinrichs DJ, Thomashow MF.1984. Introduction of pAM beta 1 into Listeria
Monocytogenes by Conjugation and Homology between Native L. Monocytogenes Plasmids.
Infect Immun. 44: 157-61.
[9] Angela Goytain, A.Quamme.2005. Functional characterization of human SLC41A1,a Mg2+
transporter with similarity to prokaryotic MgtE Mg2+ ransporter .Physiol.Genomics.
21,337-342
[10] Mao Dan-dan et al. ATMGT7, an arabidopsis gene encoding a low-affinity magnesiumg
transportor and an alternative splicing variant (待发表)
[11] Susana M, Rosalina G, Maria A et al.2001. The MgtE Mg2+ Transport protein is involved in
aeromonas hydrophila adherdnce. FEMS Microbiol Lett. 198(2): 189-195.
[12] Makino K, Oshima K, Kurokawa K et al. 2003. Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus:
a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae. Lancet 361 (9359): 743-749
[13] Sambrook J and Russell DW. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold
spring harbor laboratory press,cold spring harbor,N.Y.
[14] Mary Ann Szegedy ,Michael E .Maguire.1999. The CorA Mg2+ transpor protein of Salmonella
typhimurium. The Journal of Biolgical Chemistry.24: 319-328
[15] Colin W. Macdiarmid and Richard C.Gardner.1998. Overexpression of the
Saccharomycescerevisiae Magnesium Transport System Confers Resistance to Aluminum Ion.
The Journal of Biolgical Chemistry.273: 1727-1732
[16] Colin W. Macdiarmid and Richard C Gardner. 1996. Al toxicity in Yeast.Plant Physiol 112:
1101-1109
水稻胚乳中wee1基因表达模式的研究
湖南师范大学生命科学学院
学生姓名： 毛凯壮 N42030236 专业：生物科学 班级：2003级2班
唐贵华 N42030119 专业：生物科学 班级：2003级1班
指导教师：姜孝成教授
实实验验主主要要设设备备和和材材料料：：
PCR 仪、高速冷冻离心机、紫外检测仪、凝胶成像分析系统、超低温冰箱； 日本晴（粳稻）不同发育时期的胚乳（1—15d ）
实实验验目目的的：：
拟初步研究水稻胚乳中wee1基因表达的模式，了解wee1在水稻胚乳发育不同时期表达量的差异及作用。

实实验验原原理理：：
胚乳是水稻种子的主要成分，其发育的正常与否直接关系到水稻的产量。

水稻等禾谷类作物在胚乳发育早期的细胞周期存在核内复制现象，Wee1基因表达对核内复制有调节作用从而影响胚乳的发育及其大小。

实实验验过过程程：：
提取水稻不同发育时期胚乳的总RNA ，通过两步法RT-PCR 检测并确定wee1表达的时期及在不同时期的表达量的差异。

1、RNA 提取
分别提取日本晴不同发育时期胚乳的总RNA
1.1 药品配制及器皿处理
所使用到的金属和玻璃器皿经蒸馏水和超纯水洗净后用锡箔纸包装，180 ℃烘烤12 h 。

塑料制品则用新配制的0.1% DEPC 于37 ℃浸泡12 h ，并且高压灭菌30
min。

抽提缓冲液（为防止RNA酶降解，用0.1% DEPC处理过的超纯水配制后高压灭菌30 min）：200 mM Tris-HCl (pH 8.2)，100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1.5% SDS，2% PVP (Sigma分装, PVP40)；2% BSA (Sigma分装)；10 mM DTT (Sigma) (PVP，BSA和DTT先分别配成母液，0.22 μm过滤除菌，在使用前加入)。

蛋白酶K（Merk,Germany）。

饱和酚配制的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。

氯仿/异戊醇（24:1）。

2 M LiCl：DEPC处理，高压灭菌30 min。

8 M LiCl：DEPC处理，高压灭菌30 min。

3 M乙酸钠，pH 5.2：DEPC处理，高压灭菌30 min。

70% 乙醇：用0.1% DEPC处理过的双蒸水配制。

100% 乙醇。

1.2 操作过程
（1）将适量体积的抽提缓冲液移至100 ml离心管中，预热至56 ℃，在使用之前加入PVP、BSA及DTT至终体积20 ml，充分混匀。

研钵和研杵用液氮预冷。

（2）从-80 ℃冰箱中取出0.5g胚乳放入预冷的研钵中，加入液氮后，将胚乳充分研磨成粉末，倒入上述预热的抽提缓冲液中，颠倒离心管使之充分混匀。

（3）待离心管冷却至室温，加入200μl蛋白酶K（20 mg/ml），37 ℃水浴10 min。

（4）加入12 ml预热的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），用力摇动数分钟后，置于56 ℃水浴20 min，期间剧烈摇动3-4次。

（5）4 ℃下12000 g离心15 min。

（6）将上清转移至一新的100 ml离心管中，离心8 min。

（7）将上清液迅速转移至一新的100 ml离心管中，加入20 ml氯仿/异戊醇（24:1）。

（8）将混合物在冰上旋摇5 min混匀。

4 ℃下12000 g离心15 min。

（9）用等体积的氯仿/异戊醇（24:1）将上清夜抽提两次。

（10）将上清液转移至一新的100 ml离心管中，加入1/3体积8 M LiCl，使LiCl
终浓度为2 M，盖紧管口，倒置几次，使之充分混匀，4 ℃静置过夜。

使之沉淀。

（11）4 ℃下12000 g离心15 min，得到RNA沉淀。

（12）小心将上层液体倒去，用25 ml预冷的LiCl(2 M)清洗沉淀。

4 ℃下12000 g 离心10 min。

（13）小心倒去LiCl洗液，避免动及沉淀。

（14）用900 μl经DEPC处理的超纯水溶解沉淀，并转移至3支1.5 ml 离心管中。

（15）加入1/10体积3 M乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积预冷的无水乙醇。

-20 ℃静置过夜或者-80 ℃静置30 min。

（16）4℃下12000 g离心15 min，得到RNA沉淀，倒去乙醇，残留的乙醇用真空泵吸出；然后用1 ml预冷的70%乙醇清洗沉淀，12000 g离心5 min回收沉淀，真空泵吸出残留的乙醇。

（17）用等体积DEPC处理过的超纯水重新溶解RNA沉淀。

灭菌超纯水稀释5 μl 充分溶解的RNA溶液至500 μl，在260 nm下测定OD值；另取5 l 在1.2%的变性琼脂糖凝胶上作电泳分析（图1）；其余的分装后置于-80 ℃保存待用。

图1 日本晴发育12 d胚乳总RNA电泳图
2、逆转录及PCR检测
2.2 PCR检测
根据在NCBI上查找到的粳稻日本晴wee1基因及水稻中actin基因mRNA序列设计特异性引物如下：
wee1基因正向：5’CCT CAG CCA GAA TTT CTT C 3’
反向：3’GAC AAC TAC CAC TAC CGT A 5’
actin基因正向：5’TGT GGA CGA TGC CTG GAC 3’
反向：3’CAT TCC AGT GCG GGT CGT 5’
使用以上特异性引物，以逆转录产物为模板分别对各个时期进行PCR检测，PCR程序为：PCR反应混合物94 ℃变性4 min，42个循环的94 ℃ 1 min，52 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，68℃ 1 min，然后68 ℃再延伸4 min。

下为日本晴发育12 d胚乳逆转录后PCR检测结果图：
图2 wee1基因和actin基因片段逆转录PCR产物的凝胶电泳分析
wee1扩增片段测序结果：ACATCACGCCAGATGCGCCGCAGCTCGGGAGCGGCTTCGA CGCCAATAAGGAGAATATCCCTTGCCCCAATTCTCCAGAGAAATCAGTCTGTAGGAGCAA GAGATACAAGAGAGATTGTTCCCCCAAAGGCCTTGGCTCCAATGACATTTTTGATAGCCA GTGGATTGCTCCAGTTCAGTTTGAAGGTCTAGATGATTCAGAGGAGGAACAGCTGAAGG AATCTAGTTCGCACAAGAGAGGTAGTTATGTCTCCCAATCGGCAGTGGCTCTTCGCTGCC
GGGTGATGCCTCCACCA TGCATCAGGAATCCATACCTCAATACAGATCATCAAATAGATGA TAATGTTTTTGGTGGGAGACAATGCAAATCATCAGGGTTTTCTCCTTCTGTTGATGGTGAT GGCATAA
结果与分析：
分别提取从第4 d到第15 d的水稻胚乳总RNA并用特异性引物进行检测，在这些时期我们均检测到了wee1基因的表达，通过选择4、6、8、10、13、15 d的胚乳总RNA做半定量PCR分析，可以初步看出wee1基因的表达在第4天最多，之后开始逐渐下降，趋势如图3：也就是说水稻胚乳的细胞在发育到第四天后开始大规模进入核内复制阶段，在这个阶段细胞只进行DNA复制而不进行有丝分裂，结果使细胞内DNA含量成倍增长，从细胞形态角度观察，可看到细胞在这个阶段开始明显增大，积累更多的营养物质。

因而我们说wee1的表达对粮食作物的产量提高具有很大的影响，LARKINS等研究玉米中wee1基因的表达结果显示，玉米中的zmwee1基因在第9天开始表达，在第17天停止表达，并在第15天达到最高表达量。

这表明不同的植物中wee1基因表达存在差异，而且这种差异很有可能决定了种子的体积。

图3 不同发育时期胚乳中wee1基因表达的半定量PCR检测分析
三三种种免免疫疫纳纳米米磁磁性性珠珠检检测测病病原原菌菌的的对对比比研研究究
学院：生命科学学院
姓名：张娟 学号：N43030117 专业：生物基地 班级：03级基地班 李惠 学号：N42030124 专业：生物基地 班级：03级基地班 指导教师：邓乐教授
摘要：本研究成功地合成了三种磁性载体即氨基、醛基、环氧IDA-Cu 磁性载体，并通过各自的功能基团，将人IgG 固定于载体表面，制得三种免疫磁性载体。

将其用于致病菌金黄色葡萄球菌（S. aureus ）和G 群链球菌(Group G Streptococcus) 的检测，能够达到方便而快速地识别和分离这两种病原菌的目的。

三种载体检测性能的对比研究表明：醛基磁性载体的捕获和分离效果最佳，且用乙醛—右旋糖苷包被醛基免疫磁性载体可以消除交叉反应。

此研究还表明：将不同的生物功能基团连接到合成的磁性颗粒上，赋予其生物大分子的识别特性和磁性颗粒的磁性。

所构建这种的体系可以用来快速地检测和分离靶标物质，广泛地用于生物化学分析。

关键词：磁性颗粒，人IgG 的固定，检测，病原菌
A study to detect pathogens with three immuno-magnetic beads
Abstract: We successfully synthesized three different kinds of MB with the functional groups of amino groups, aldehyde groups and epoxy-IDA-Cu groups, respectively. Human IgG was immobilized onto each kind of MB surface via their functional groups ，and the IMB were obtained. All the three kinds of IMB could be used for rapid detection and separation of the S. aureus and GGS conveniently and rapidly. The study indicates that: The best efficient IMB was aldehyde IMB.And, aldehyde-dextran can be selected to coat aldehyde IMB to avoid the none-specific interactions. From this study, it could be inferred that by connecting different bio-functional molecules to the MB, we can endue the compounds both abilities of bio-functional molecules and MB, which were the recognize ability and the super paramagnetism. This established system could be widely used in bio- analytical chemistry to detect the targets and separate the targets in one step rapidly. Key words: magnetic bead , Hunan IgG immobilization ,detection, pathogen
微生物检测技术就是从样品中分离和鉴定目的微生物。

通常我们使用选择性培养基来获得单个的纯化的微生物。

如果对于受到损伤的和热应激的微生物还需经过增菌培养，增菌过程包括前增菌、选择性增菌和后增菌。

因此，实际上检测时间主要是等待增菌的时间，这样。