恒温扩增技术的原理与用途探究

即通过对靶序列的特异性扩增，使其产生大量拷贝，以达到检测水平。

主要包括以下技术。

环介导等温扩增技术，又称为环媒恒温扩增技术或连环恒温扩增技术，是由等于2000年所开发的一种核酸扩增技术[7]。

的核心是具有链置换活性的聚合酶的应用以及基于靶核酸6个特异性片段即5’端的1、2和3区和3’端的3、2和1区，其中2区和2区为目的扩增片段的4条特殊引物的设计，分别为上游内部引物，由1区和2区组成、下游内部引物，由1区和2区组成、上游外部引物3，由3区组成及下游外部引物3，由3组成。

整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段。

⑴起始阶段的2序列首先和模板2结合，引导合成互补链；随后，3与模板3结合，在聚合酶的作用下启动链置换合成并释放出结合有的完整互补链。

此单链5’端1和1自我碱基配对形成环状结构。

以此链为模版，引物和3以相同的方式引导另一端链合成、链替换，从而形成哑铃状结构的单链。

1末端可自发引导补齐中间单链缺口,使哑铃状单链转化为双链茎环结构。

此产物可作为下一阶段的起始物为基因的扩增循环提供模板。

⑵循环扩增阶段引物与茎环结构结合,以双链中一条链为模板延伸,并释放出另一条链,；释出链游离3端自身成环,引发链延伸取代并释放引导合成的链,两产物均可作为下一循环的起始物。

引物和与上述产物的茎环结合重复以上延伸过程,使产物延长同时释放新的链成环并作为新的起始物。

其最终产物为一系列长度不同的茎环状双链片段。

灵敏度高、特异性好，且操作简便、快速，结果易于判定，这些优点
使得该技术自成立十余年以来在病毒、细菌、寄生虫等各类病原体的基因检测上得到了广泛应用。

如、、等分别建立了巨细胞病毒、病毒、人类疱疹病毒6型6的检测方法[8-10]；、-、等分别针对肺结核分支杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌建立了检测体系，并对其灵敏度和特异性进行了评价[11-13]；而、等分别以弓形虫病、四种疟原虫疾病为研究对象，比较了与-、的检测效能，证明技术可以作为流行区现场快速而简便的疾病筛选工具[14,15]。

但因建立时间较短，仍存在一些不足，其中最大的缺点就是容易出现假阳性。

由于采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出现非特异性条带。

此外，产物鉴定只针对有或无，缺乏一定的特异性。

1989年首先报道的以转录为基础的和核酸扩增技术[16]。

该技术从互补的靶核酸一般为合成分子开始，以新合成的为模版进行转录。

反应体系主要涉及三种酶活性7聚合酶、核糖核酸酶和逆转录酶和两条特异引物。

整个反应过程可分为非循环相和循环相。

在非循环相中，以单链为模板，先后在逆转录酶、核糖核酸酶和聚合酶的催化作用下，生成带有7启动子的双链；此双链在7聚合酶的催化下合成大量互补于靶序列的反义，由此进入循环相。

循环相中，以反义为模板，经重复循环的进行合成、降解、7聚合酶催化转录，使目的不断得以扩增。

主要包括两种反应体系，即依赖核酸序列的扩增-,和转录介导的扩增,。

前者又称为自主序列复制系统-,3，于1990年由等首先报道[17]；1991年，对此进行了详细描述[18]。

该反应体系所涉及的三种
酶为鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶、和7聚合酶。

反映在42℃条件下，15内即可将模版扩增至109~1012倍。

相对于的三酶体系，使用的是二酶体系，即鼠白血病病毒逆转录酶和7聚合酶。

兼具有逆转录酶和的活性，因此可省略，从而降低反映成本，且使体系更稳定。

近年来，与实时荧光检测技术相结合，出现了实时荧光核酸恒温扩增检测技术，以直观反映扩增循环情况。

非常适用于单链靶的扩增，且不需-中的分离过程，从而使病毒的检测变得更加方便。

等人利用以为基础的方法对包括禽流感病毒、手足口疾病病毒在内的多种动物病毒进行了检测，证明了在动物疾病监测中的适用性[19]；-等针对-1建立了实时多重，并对该方法的分析性灵敏度和特异性以及临床灵敏度和特异性进行了评估，得出结论该方法可以作为-1双重感染病人筛查的廉价工具。

此外，在支原体、衣原体、细菌、寄生虫等病原体的检测中也得到了应用[20,21]。

然而，循环过程较为复杂，须重复加入转录酶和7聚合酶，因此还有待进一步改善。

是1992年美国学者等首次提出的基于酶促反应的体外扩增技术[22]。

反应体系涉及一种限制性内切酶、一种具有链置换活性的聚合酶、两对引物、及钙、镁离子和缓冲系统。

反应过程可分为模版的制备、两端带有酶切位点的目的片段的生成和循环三个阶段。

基本原理是引物与靶序列在3’端杂交，形成两端均为5’悬端的双链。

引物链的5’悬端含有限制酶Ⅱ的识别位点，外切酶缺陷的聚合酶以其中一种为-磷酸硫酸化三磷酸腺苷为底物延伸3’端。

Ⅱ限制性核酸内切酶在半磷酸硫酸化识别
位点的未保护链上打开缺口，而修饰的互补链保持完整。

切口处聚合酶通过延伸其3’端而替代另一条链；该替代链与引物杂交后又可作为另一反义扩增的靶源，从而实现目标序列的指数增长。

的扩增效率高，反应时间短，特异性强，不需要特殊的仪器设备。

等采用扩增结核分枝杆菌总中的一段序列，37℃2后即可将靶序列扩增108倍[23]。

然而，所存在的一些缺陷，如需四条特异性引物及经修饰的作为底物、靶序列准备复杂、产物不均一等，限制了该技术的应用范围。

为此，很多研究者在普通的基础上做了近一步改善。

如和等分别利用两组特异引物和一组随机引物建立了两种新的链置换扩增技术，即等温多重链替换扩增是由美国的等模拟动物体内的复制机制所发明的一种新的体外基因扩增技术[26]。

其基本原理是利用解旋酶打开双链；再依靠单链结合蛋白与模板结合，使模板处于单链状态并保护其完整性；随后引物与模板杂交，并在聚合酶的催化下扩增；新生成的双链可作为底物进入下一轮的反应。

与其他恒温扩增技术相比，操作过程更加简单，且整个过程可在同一温度下进行，可谓是真正的等温扩增。

的这一优势表明，该技术在研发现场和作为基层诊断工具方面具有很大潜力。

在的基础上，,等开发了一种7复制机器包括7解旋酶、外切酶缺陷的7聚合酶和725，从而建立了一种新的扩增方式—依赖解旋酶的环形扩增-,，利用可以在同一温度下同时筛选和扩增环形样本，如质粒[27]。

等采用新型的恒温荧光定量核酸扩增分析技术-检测炭疽杆菌与霍乱弧菌等病原菌，提出此技术比传统的扩增技术具有更好的稳定性和特
异性，明显改善了技术的假阳性与假阴性的问题[28]。

作为一种崭新的恒温核酸扩增方法，目前仅处于初期阶段，从敏感性、准确性和可操作性几方面看，该方法还具有很大的发展空间。

受解旋酶的限制，目前主要用于扩增小片段的序列，还有待于寻找更有效的解旋酶以扩大该技术的应用空间。

技术是借鉴自然界中环状病原微生物分子的滚环式复制方式而建立的一种核酸扩增技术，包括线性扩增和指数扩增两种方式[29]。

线性扩增是指将一条引物结合到环状上后，在聚合酶的作用下延伸，产生大量与靶核酸互补的、含重复序列的线状单链。

的延伸可不断进行，产生的链在长度上连续分布，因此经凝胶电泳后可见一条宽弥散带。

线性用于靶核酸的扩增时，仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，而且限于200以下长度的环。

由于其单链扩增性，扩增产物一般可始终连接在固相支持物的引物上，非常适宜于固相形式微阵列局部特异信号的检测。

指数技术，又称之为超分支滚环扩增-,或分支扩增,。

此技术是在线性的基础上增加一条与环状序列完全一致的引物，该引物与线性产物杂交并酶促延伸，延伸产物可作为第一条引物的模版进行扩增。

如此一来，扩增产量在短时间内成指数递增。

曹娜娜等将方法与电子芯片有机结合起来，在电子芯片上进行扩增，以大肠埃希菌的157志贺毒素基因22，2作为检测靶基因，确定了该方法的可行性[30]。

等利用φ29聚合酶和一组随机引物，在的基础上建立了一种新的扩增技术，即多重引物滚环复制-，其扩增产物可用于测序、体外克隆、文库建立及其他分
子生物学研究，目前该技术在病毒基因组学的研究上已得到了广泛应用[31,32]。

核酸信号放大技术主要用于核酸分子不能直接扩增或核酸分子浓度过低而无法检测的情况。

目前主要包括以下技术。

21分支放大系统,,即分支，是人工合成的带有多个分支的片段，其每个分支均可作为酶标位点，从而实现信号的放大。

技术由公司的、等所构建，其基本原理是用亲和素包被微孔；加入5’端标记有生物素的第一组探针捕获探针，该探针不仅可与微孔中的亲和素结合，且与待检靶序列上的某区域互补；然后在微孔中加入待检靶片段，与固定于微孔中的捕获探针结合；再加入第2组探针，该探针一段与靶片段的某一区域互补结合，另一段与的主链部分序列互补结合；的每一分枝上都标记碱性磷酸酶；以金刚烷作为底物，经碱性磷酸酶作用可发射光子，由荧光分析仪检测化学发光信号报告结果。

等将技术与以液相芯片荧光微珠为基础的平台相结合，建立了一种高特异性的检测方法—多重分支。

该方法不需经过的纯化或目的片段的扩增，直接以细胞裂解物和组织匀浆为标本即可测定多重基因的表达水平。

多重技术为大规模样本特定基因表达图谱的测定提供了强有力的工具[33]。

22侵染探针技术是美国三波技术公司所开发的一种等温和定性和定量检测方法。

该技术使用一个耐热的内切核酸酶，根据结构特征在特异位点切割核酸分子。

体系包括两个特异性寡核苷酸引物上游引物和下游引物，又分别称之为侵染探针和信号探针。

反应过程中，上游引物全部序列和下游引物3’端均能与靶核酸杂交结合，下游引物带有荧光标记的5’端
因不能与靶核酸结合，就如同在上游引物的侵入下而形成的翼状突出。

内切核酸酶可识别这种特定结构并将其突出的5’端剪切下来，被剪切的信号探针则与靶核酸分离。

随后新的信号探针再次与靶核酸杂交结合，而后被剪切。

每个靶核酸每小时能促使释放上千个翼，所释放的5’翼在含有荧光共振能量传递的通用报告系统中，又可作为第二次入侵的侵染探针，再次形成侵入结构从而被内切酶识别切割，从而进一步达到信号放大的效果。

切割下来的5’翼可用荧光板读取器检测，其荧光强度与靶分子量成正比。

体系无需核酸扩增即可直接从基因组中检测目的基因。

该方法方便、快捷，同时具有较高灵敏度，因此可用于实时监测。

此外，因碱基错配可抑制内切酶的识别与剪切，所以该体系也适用于大范围检测基因组单核苷酸多态性[34]。

恒温扩增各技术原理不同，这使得每一项技术在其发展应用过程形成了自己的特色，总结如下。

尽管恒温扩增技术各有优缺点，且扩增方式各不行同，所需要本量、样本处理方式等也存在很大差异，但这些特点注定恒温技术将优于非恒温技术，在分子生物学发展中占有一席之地。

而操作简便、过程恒温的本质，使得这些技术在开发便携式基因诊断工具方面具有很大潜力，这将极大促进和改善很多疾病的快速诊断技术和现场筛查现状，从而为人类的健康做出巨大贡献。

本文作者贾利芳韩建平胡薇工作单位中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。