天然脱镁叶绿酸a提取技术和测定方法的研究进展

天然脱镁叶绿酸a提取技术和测定方法的研究进展
圣倩倩;祝遵凌
【摘要】综述了脱镁叶绿酸a化合物的提取技术及测定方法。

提取技术如丙酮法、乙醇法、丙酮-乙醇法、Hynninen选择性酸法、酸碱法、甲醇法，测定方法有分
光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱分析法等。

通过对脱镁叶绿酸a提取和分
析方法的总结和比较，提出这些方法的优缺点，指出今后脱镁叶绿酸a提取工艺
的改进和发展方向，旨在为脱镁叶绿酸a的进一步研究、开发、应用提供依据。

%The extraction technology and the analysis method of PheoPhorbide a comPounds were summa-rized. The extraction techniques contain acetone,ethanol,acetone-ethanol method,Hynninen selective methods of acid hydrolysis,acid-alkali and methanol,and the analysis methods include sPectroPhotometry, high Performance liquid chromatograPhy,thin layer chromatograPhy. According to the summarizing and the comParison for
the extraction technology and analysis method of PheoPhorbide a comPounds,the advanta-ges and disadvantages were found out and analyzed,and so as to take use of the advantages in the Process of the later extraction. Thus it can greatly imProve the efficiency of extraction and Provide the basis for the further research,develoPment and aPPlication of the PheoPhorbide a in the future.
【期刊名称】《应用化工》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】5页(P1324-1327,1330)
【关键词】脱镁叶绿酸a;提取技术;测定方法;总结与展望
【作者】圣倩倩;祝遵凌
【作者单位】南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037;南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037; 南京林业大学艺术设计学院，江苏南京 210037【正文语种】中文
【中图分类】TQ281
卟啉类化合物是一类天然光敏活性剂［1］，在恶性肿瘤的诊断和光动力治疗中发挥了较为重要的作用［2-3］。

而脱镁叶绿酸a(pheophorbide a)作为一种卟啉化合物，是高等植物和藻类的叶绿素中间代谢产物［4］，且已有相关报道脱镁叶绿酸a是一种光动力复合物［5-6］，可用于光动力疗法［7］。

脱镁叶绿酸a是由叶绿素分子脱去镁离子后进一步水解而形成的化合物，具有显著的抗炎、抗肿瘤、保护胃肠粘膜等药理作用［8-10］。

Stermitz等［11］证明了脱镁叶绿酸 a是一种强有力的外排泵抑制剂。

Charles等［12］研究发现动物粪便中含有的脱镁叶绿酸a对肠原杆菌具有有效的外排泵抑制特性。

目前，脱镁叶绿酸a是叶绿素降解的中间产物，在茶叶、柑橘、老化叶中普遍存在，但含量低、分离困难，而其需求量日益加大，这就形成了供不应求的局面。

本文综述了国内外近年来对脱镁叶绿酸a的提取技术和测定方法，常见的提取技术有丙酮法［13］、乙醇法［14-16］、丙酮-乙醇法、Hynninen 选择性酸法水解［17］、酸碱法［18］、甲醇法，测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱分析法。

旨在通过对脱镁叶绿酸a化合物提取方法和测定方法的总结和比较，找出其中的优缺点，以便能在以后的提取过程中发挥其优势，从而大大的提高
提取效率，为以后脱镁叶绿酸a进一步研究、开发、应用提供依据。

1 天然脱镁叶绿酸a的提取方法
1.1 丙酮法
丙酮法是一种传统的提取方法。

丙酮作为有机溶剂，提取绿色植物叶片中的粗品叶绿素，使用30%盐酸脱去金属离子和植醇长链，得到主要产物脱镁叶绿酸a。

王
章阳等［19］通过正交实验法优化丙酮法的工艺条件，2次提取蚕砂中的脱镁叶
绿酸，70℃的提取温度，5 h以上的软化时间，1 h的提取时间，1/10倍干药材
量的软化用量，3倍于药材量的溶媒用量，酸化，将pH调至2.5，60目的粉碎度，使得脱镁叶绿酸提取率提高了4.6倍。

马士成［20］用水将蚕砂洗净后，自然风干，丙酮中回流提取，抽滤，收取滤液，浓缩近干，加乙醚、HCl混合液剧烈振摇后萃取，分离下层水溶液，加入冰块，用饱和NaOH将pH调至3左右，离心，
沉淀即为脱镁叶绿酸a，离心液过滤后用EDTA滴定，测得脱镁叶绿酸a提取率为
0.3%。

1.2 乙醇法
其原理是叶绿素分子为双羧酸的酯，一个为甲基所酯化，另一个为叶醇基所酯化，经皂化反应及酸化脱镁后，得到脱镁叶绿酸a。

王章阳等［19］取中药材蚕砂50 g，加水软化，比例较少，用95%乙醇150 mL，10%NaOH调pH至12～13，70℃水浴提取1 h，测得提取率为0.072 6%。

马士成用水将蚕砂洗净后摊晾近干，用95%乙醇和10%NaOH调pH，水浴提取，抽滤，收取滤液，浓缩，加水稀释
浓缩液，振摇，用石油醚萃取下层皂化物至石油醚无色，下层皂化液加30%HCl
调pH至3左右，离心，沉淀即为脱镁叶绿酸a。

离心液过滤后用EDTA滴定，测得提取率0.07%。

对于丙酮法和乙醇法，王章阳和马士成一致认为丙酮法制备脱镁叶绿酸a的提取
率高于乙醇法。

且马士成认为提取的最佳条件为:提取2次，70℃的提取温度，5 h
以上的软化时间，1 h的提取时间，1/10倍于原料的软化用量，3倍于原料的溶
媒用量，酸化时调pH至2.5，60目的粉碎度，使得最后的提取率提高3.6倍。

1.3 丙酮-乙醇法
其原理是利用丙酮与乙醇按照不同比例混合作提取剂，将从绿色植物叶片中提取的叶绿素在强酸条件下脱去镁离子，生成脱镁叶绿酸。

吴真等［21］认为对蚕砂软
化时间2 h(含水量26%)、丙酮-乙醇(1∶2，v/v)作为提取叶绿素的溶剂效果最好，然后以蚕砂叶绿素粗品合成叶绿素衍生物脱镁叶绿酸，浓盐酸脱镁搅拌反应72 h，最后的脱镁叶绿酸a制备率达67%。

而康玲等［22］则以蚕砂软化时间(含水量)、不同提取溶剂为考察条件，探讨浓盐酸脱镁时间对叶绿素合成脱镁叶绿酸制备率的影响，结果表明，蚕砂2 h(含水量26%)的软化时间、体积比1∶1的丙酮与乙醇
作为提取叶绿素的溶剂效果最好，然后再使用蚕砂叶绿素粗品合成脱镁叶绿酸，浓盐酸脱镁搅拌反应72 h，制备率达670 mg/g。

1.4 Hynninen 选择性酸法水解［17］
由于叶绿素a与叶绿素b水解能力不同，以30%盐酸选择性地使叶绿素a植物醇基酯键水解，叶绿素b则不水解，以达到使二者分开的目的。

使用糊状叶绿素，
直接将叶绿素a水解成脱镁叶绿一酸a，经盐酸与乙醚按不同比例分离，获取脱镁叶绿一酸a，按Hynninen公式计算脱镁叶绿一酸的含量为88%。

进一步使用薄
层色谱法提纯，含量高达99%［18］。

这种方法不仅提取效率高，而且所含杂质
也较少。

吴真等向蚕砂叶绿素粗品中直接加盐酸制备脱镁叶绿酸a，收率为67.3%，比常规工艺提高3倍多。

1.5 酸碱法
其原理是用浓度较高的盐酸水解叶绿素，主要得到脱镁叶绿一酸a，这表明脱镁叶绿素b的酯键对酸稳定，而叶绿素a的甲酯键和戊酮环也稳定。

但碱水解叶绿素
脱脂和开环很容易，但要提取脱镁叶绿二酸a和脱镁叶绿三酸a，需要设法控制碱
的用量，而以碱法制备叶绿一酸a不易控制［18］。

孙彩云［23］采用碱法水解
制备脱镁叶绿酸，称量50 g蚕砂，加入30 mL水软化5 h以上，再加入提取剂
丙酮(95%)与乙醇(1∶1)混合溶液200 mL，于45℃水浴锅中加热2 h，进行2次
提取，然后过滤，将叶绿素提取液收集在烧瓶里，再加入10%NaOH溶液，将
pH调至12左右，60℃水浴皂化回流1 h，然后减压蒸馏并回收溶剂。

将皂化液
用等体积的石油醚萃取3～5次，舍去上层黄色油相，收集下层水相(墨绿色皂化液)，搅拌并滴加20%HCl溶液，将pH调至2～3，再在45℃的水浴锅中加热30 min，产生的脱镁叶绿酸沉淀为深褐色。

1.6 甲醇法
Cheng等［24］利用甲醇提取爪哇大青中的脱镁叶绿酸a，再利用正己烷、氯仿
和乙酸乙酯对甲醇提取物进行分馏，结合核磁共振波谱和脱镁叶绿酸a标准品进
行分析，提取并测定脱镁叶绿酸a。

使用这种方法虽然工艺比较简单，提取时间短，但提取物中含有的杂质较多，提取效率低。

2 天然脱镁叶绿酸a的测定方法
2.1 分光光度法
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中脱镁叶绿酸a的含量。

进行含量测定
时选择脱镁叶绿酸a的最大吸收波长，这样做一方面灵敏度大，物质在含量上的
稍许变化将引起较大的吸光度差异，另一方面可以避免其它物质的干扰。

此外，分光光度法具有简便快捷，且对仪器设备要求不高等优点［25］。

王永等［26］使
用可见分光光度计测定大麦苗粉中脱镁叶绿酸a的含量时，根据脱镁叶绿酸可溶
于乙醚的性质，以乙醚作对照，由于其在667 nm处有最大吸收蜂，故选定667 nm作为测定波长测定样品的吸光值。

而Ewa Cieckiewicz等研究欧洲鹅耳栎叶片中的脱镁叶绿酸a，得出紫外/可见光谱在408 nm有一个很强的吸收峰，666 nm 有一个较小的吸收峰。

孙彩云［23］采用紫外-可见分光光度计(UVVis)扫描已提
取的脱镁叶绿酸的吸收曲线。

James等［27］通过对不同浓度的凉拌卷心菜提取
液使用分光光度计进行测定，表明酸性条件下其提取液内的脱镁叶绿酸a含量较高。

Frank等［28］利用可见光吸收光谱和核磁共振分析从茵陈蒿中提取出脱镁
叶绿酸a。

2.2 高效液相色谱法
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.910 7 Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒
径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几
十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

目前多使用制备型高效液相色谱法测定脱镁叶绿酸单体的含量，制备型高效液相色谱法具有制备量大、产率和纯度高、分离速度快等特点，但该方法由于在流动相中大多使用高浓度的缓冲盐或酸，对系统特别是液相柱损害较大。

李洪玉等［29］采用HPLC法
测定竹叶叶绿素衍生物脱镁叶绿酸a的含量时，填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶，
色谱柱:C18 diamonsil 5 μL(150 mm × 4.6 mm I.D)，流动相:MeOH-
HAc(10∶0.1)，409 nm 的紫外检测波长，定量分析脱镁叶绿酸a，这种方法简单、快速、准确，适用于脱镁叶绿酸a含量的测定和质量控制。

吴方评等［30］用90%丙酮振荡并提取烟草中含有的脱镁叶绿素，将提取液在Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱上预分离和富集，固定相为Waters Xterra TM RP18(1.0 mm ×50 mm，2.5 m)色谱柱，流动相为(1+1)甲醇异丙醇溶液-水梯度，烟叶中的脱镁叶绿素将在其最大吸收波长下分离提取，最后通过色谱峰面积来计算含量。

2.3 薄层色谱法
薄层层析法也称薄层色谱法(thin-layer chromatography)，是快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术，常用TLC表示。

TLC是色谱技术的一种。

与
经典的分离提纯手段(重结晶、升华、萃取和蒸馏等)相比，薄层色谱法具有微量、
快速、分离效率高和灵敏度高等优点，但在分辨率及重现性等方面不如高效液相色谱法和气相色谱法，一般用作定性和半定量的手段［31］。

Rf值的大小与展开剂的极性有很大关系，常用的展开剂有石油醚、四氯化碳、甲苯、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸等［32］。

徐磊［33］通过采集香樟树叶，从中提取叶绿素，展开剂为四氯化碳、丙酮、甲酸(14∶7∶1)，使用薄层层析法(TLC)对脱镁叶绿酸 a进行纯化，进行定量分析。

纪平雄等使用相关报道的薄层层析展开剂(四氯化碳∶丙酮∶甲酸=70∶29∶1)在硅胶薄板上不能将蚕砂中含有的脱镁叶绿酸a成分分开，而使用比例为14∶7∶1时，该展开剂能有效地将脱镁叶绿酸a分开，效果明显优于相关报道的展开剂比例。

而Ewa等以二氯甲烷和乙酸乙酯(9∶1)为展开剂对欧洲鹅耳栎的脱镁叶绿酸a进行分离和纯化的效果良好。

说明展开剂的选择需要根据特定的植物性质而定。

3 结束语
本文总结出的几种提取脱镁叶绿酸a的方法虽然方法简单易行，但均比较传统，提取效率低，仍需要科研工作者进行进一步探索脱镁叶绿酸a的分离纯化方法，由于自然界含有脱镁叶绿酸a的药用植物种类数量繁多，作为植物次生代谢产物的一大类家族，具有光动力作用，是一种潜在的抗癌物质，具有广阔的应用前景。

因此在未来的研究中对富含脱镁叶绿酸a结构的植物进行深入研究，以期能够与抗癌药物结合起来，共同促进人类生物医学方面的发展。

参考文献:
【相关文献】
［1］ Prapai Wongsinkongman，Arnold Brossi，Wang H K，et al.Pheophorbide-a derivatives as photo-independent cytotoxic agents［J］.Bioorganic Medicinal Chemistry，
2002，10:583-591.
［2］金小敏，吴建.卟啉类光敏药物的研究进展［J］.中国药物化学杂志，2002，12(1):52-56. ［3］ Koshiro Umimura，Nagahiko Yumita，Ryuichiro Nishigaki，et al.Photodynamically induced antitumor effect of pheophorbide a［J］.Cancer Letters，1996，102:151-157. ［4］ Hortensteiner S，Wuthrich K L，Matile P，et al.The key step in chlorophy II breakdown in higher plants.Cleavage of pheophorbide a macrocycle by a monooxygenase ［J］.The Journal biological chemistry，1998，273:15335-15339.
［5］ Chee C F，Lee H B，Ong H C，et al.Photocytotoxic pheophorbide-related compounds from Aglaonema simplex［J］.Chem Biodivers，2005(2):1648-1655.
［6］ Cheng H H，Wang H K，Ito J.Cytotoxic pheophorbide-related compounds from Clerodendrum and C.cyrtophyllum［J］.J Nat Prod，2001，64:915-919.
［7］ Ewa Cieckiewicz，Luc Angenot.Potential anticancer activity of young Carpinus betulus leaves［J］.Phytomedicine，2012，19:278-283.
［8］郑国栋，欧阳文，顔苗，等.叶绿素及其衍生物的药理研究进展［J］.中南药学，2006，
4(2):146.
［9］ Nakatani Y，Qurisson G，Beck J P.Chemistry and biochemistry of Chinese
drugs.Vll.Cytostatic phephytins from silkworm excreta，and derived photocytotoxic pheophorbides［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1981，29:2261-2269.
［10］ Nakamura Y，Murakami A，Koshimizu K.Type II secretory phospholipase A2 associated with cell surfaces via C-terminal heparin-binding lysine residues augments stimulusinitiated delayed prostaglandin generation［J］.The Journal Biological Chemistry，1996，60:1028-1030.
［11］ Stermitz F R，Beeson T D，Mueller PJ，et al.Staphylococcus aureus MDR efflux pump inhibitors from a Berberisand a Mahonia(sensu strictu)species［J］.Biochem Syst Ecol，2001，29:793-798.
［12］ Charles A Barnes，Sharon L Rasmussen，Jacob W Petrich，et al.Determination of the concentration of potential efflux pump inhibitors，pheophorbide a and pyropheophorbide a，in the feces of animals by fluorescence spectroscopy［J］.Journal
of Agricultural and Food Chemistry，2012，60:10456-10460.
［13］萧竞之.叶绿素铜的制备［J］.药学通报，1964，10(4):179.
［14］原毅.糊状叶绿素、叶绿素铜和叶绿素铜钠的制备［J］.化学世界，1989(1):88.
［15］胡龙勤，许德余.新型肿瘤光化学诊治剂脱镁叶绿酸a的化学研究［J］.第二军医大学学报，1986，7(6):405.
［16］李晓勇，陶海鹏，俞华珊，等.亚硒酸錳(Ⅲ)-叶绿酸钠的制备及其对小鼠的急性毒性和小鼠
肝癌的初步试验［J］.华西药学杂志，2000，15(1):6.
［17］ Hynninen P，Lotjonen S.Preparation of phorbin derivatives from a chlorophyll mixture utilizing the principle of selective hydrolysis［J］.Synthesis，1980，7:539-541.
［18］纪平雄，张廿六，陈芳艳，等.三种脱镁叶绿酸a的分离与鉴定方法探讨［J］.中国蚕业，2001，22(1):13-14.
［19］王章阳，周滢.从蚕砂中制备脱镁叶绿酸的工艺研究［J］.中国药房，2001，12(3):148-149. ［20］马士成.叶绿素衍生物光敏助氧化作用的生物学效应研究［D］.杭州:浙江大学，2007. ［21］吴真，康玲，丛媛媛，等.蚕砂叶绿素提取及合成脱镁叶绿酸工艺研究［J］.中药研究与开发，2012，19(9):52-54.
［22］康玲，吴真，丛媛媛，等.蚕砂叶绿素提取及合成脱镁叶绿酸工艺改进研究［J］.中国现代应用药学，2012，29(8):700-702.
［23］孙彩云.脱镁叶绿酸锌的制备及红外光谱研究［J］.唐山师范学院学报，2011，33(5):34-36. ［24］ Cheng Hueyhwa，Wang Huikang，Junko Ito，et al.Cytotoxic pheophorbide-related compounds from Clerodendrum calamitosum and C.cyrtophyllum［J］.J Nat Prod，2001，69:915-919.
［25］范以辉，惠焕强.浅谈分光光度法和分光光度计的原理及其应用［J］.计量与测试技术，2006，33(12):11-12.
［26］王永，兰青阔，赵庆伟，等.分光光度法测定大麦苗粉中脱镁叶绿酸的含量［J］.食品研究与开发，2009，30(7):110-112.
［27］ James W Heaton，Rickey Y Yada，Alejandro G Marangoni，et al.Discoloration of coleslaw is caused by chlorophyll degradation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(2):395-398.
［28］ Frank RStermitz，Jeanne Tawara-Matsuda，Peter Lorenz，et al.5’-Methoxyhydnocarpin-D and pheophorbide A:Berberis species components that potentiate berberine growth inhibition of resistant staphylococcus aureus［J］.J Nat Prod，2000，63:1146-1149.
［29］李洪玉，孙静芸，章建民.HPLC法测定竹叶叶绿素衍生物脱镁叶绿酸a的含量［J］.现代中药研究与实践，2003，17(3):19-20.
［30］吴方评，董学畅，张甜，等.微柱高效液相色谱法测定烟草样品中植物色素的研究［J］.云南化工，2005，32(2):24-27.
［31］ Lee Meihwa，Lin prasion of techniques of isoflavones from the root of Radix Puerariae:Ultrasonic and pressurized solvent extractions［J］.Food Chemistry，2007，105:223.
［32］王君玲，贾淑梅.薄层色谱法及其在药物、色素分离等方面的应用［J］.锦州师范学院学报:
自然科学版，2003，24(1):14-16.
［33］徐磊.脱镁叶绿酸a的制备及抑菌研究［D］.苏州:江南大学，2005.。