细胞实验RNA的干扰

细胞生物学实验
动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术
一、实验目的
1、学习和掌握外源基因导入动物细胞的方法，观测外源基因的表达（绿色荧光蛋白），并了解细胞转染技术在细胞生物学相关领域的应用。

2、学习和掌握RNA干扰技术原理，学习观测利用化学合成的GFP-siRNA对GFP蛋白的抑制效果。

二、实验原理
（一）绿色荧光蛋白
1、GFP荧光蛋白的发现
1962年,下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。

它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。

1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。

1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。

2、GFP荧光蛋白的应用
GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、药物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。

GFP具有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.
（二）转染
1、转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。

2、真核细胞基因转染的方法
（1）磷酸钙法：磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，瞬时性转染不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用。

（2）DEAE-右旋糖苷法：带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清。

（3）阳离子性的脂质体法：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染。

3、影响转染的因素（1）转染试剂：最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

（2）细胞状态：一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。

最适合转染的细胞是经（3）过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。

（4）细胞密度：细胞密度对转染效率有一定的影响。

一般转染时贴壁细胞密度50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书和后续实验的要求。

（5）血清：一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。

不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是可添加的。

（6）抗生素：细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。

比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。

（7）氮磷（N/P）比：N/P比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表示），在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高，之后达到平值，但毒性也随之而增加，因此在实验之前应根据推荐比例，确定本实验的最佳转染比例。

（8）DNA质量：DNA质量对转染效率影响非常大。

一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

（三）RNAi（RNA interference，RNA干扰）
与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。

其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。

已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。

RNAi相关技术是研究转录后调控的有效工具，可用于功能基因组学研究以及基因治疗等临床用途。

三、实验材料
（1）仪器：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台
（2）材料：培养瓶，试管，移液管， 75%酒精棉球，酒精灯，GFP质粒、HeLa细胞滴管（3）试剂：完全培养基（DMEM），胰蛋白酶，小牛血清、TRANSfection转染试剂、胰酶
四、实验步骤
1、入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。

要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。

2、关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

打开照明灯。

3、超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。

4、准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。

5、将HeLa细胞（约4×105）在不含抗生素的培养基中接种于六孔板中，37℃、5%CO2条件下培养细胞至70-70%融合度。

（助教师姐已经做完）
6、配置GFP-siRNA、control-siRNA溶液，取GFP-siRNA、control-siRNA试剂管轻轻离心，在超净台中每管分别加入50 μL灭菌水。

7、每2各同学无菌取出4个1.5mL离心管，标上A、B、C、D
8、从D管中吸取250μL 脂质体DMEM溶液，分别加入A、B、C中，室温放置20min。

9、细胞换液：弃去旧培养基，每孔加入1.5mL无血清、无抗生素的DMEM培养基，将A、B、C转染混合液分别加入相应孔中，注意要均匀滴入孔中各处。

10、4-6h后换成含有10%血清的DMEM培养基。

（10）37℃、5%CO2条件下培养至48h，观察
并照相。

大约48小时后，我们对实验结果进行观察并照相，以下是我们小组的实验结果：
图1：GFP+GFP-siRNA（实验组1）图4：GFP+GFP-siRNA（实验组2）
图2：GFP+control-siRNA（实验组1）图4：GFP+control-siRNA（实验组2）
图3：GFP+无菌水（实验组1）图6：RFP+无菌水（实验组2）
由上图1至图6可观察到，图2、图3中绿色荧光蛋白的表达均比图1多，图1中由于GFP-siRNA的干扰，绿色荧光蛋白的表达明显的下降。

而图5、图6（图6为红色荧光蛋白的表达）中的荧光蛋白也均有表达，图5，图6中绿色荧光蛋白的表达依旧多于图4，图4中由于GFP-siRNA的干扰，绿色荧光蛋白的表达明显的下降。

因此可以得出结论GFP-siRNA可以特异性抑制绿色荧光蛋白基因的表达。

但是相对于图2、图3，图5、图6的绿色荧光蛋白的表达量偏低，推测可能是由于接种细胞时出现了操作上的失误，没有将细胞悬液混合均匀，导致每孔的数目不尽相同，图5、图6中的细胞数目接种过少。

也有可能是由于染色的问题导致实验组2的绿色荧光蛋白的表达量偏低。

六、实验思考题
1、绿色荧光蛋白在科研中的应用有哪些？
（1）GFP在检测肿瘤血管形成方面的应用
肿瘤血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必备条件,如果没有新生血管供应营养,肿瘤达到1～2mm的直径将不再增大。

因此,测定肿瘤内微血管密度, 可以判断患者预后,通常测定MVD 的方法是以抗血管内皮细胞抗体显示血管,计数阳性染色的新生血管数目。

由于切片固定和脱水过程中可出现组织体积和形状的改变,采用免疫组化法获得的MVD 值可靠性较差；（2）GFP在抗肿瘤药物筛选中的应用
GFP 作为一种报告基因,转染肿瘤细胞后,将随着肿瘤细胞的分裂、生长而传给下代,也将随着肿瘤细胞的死亡而消亡。

根据这一特性,人们已将GFP应用于抗癌药物的疗效评价、肿瘤耐药机制的研究。

Chambers 等将GFP 转染卵巢癌细胞SKOV3 ,在筛选出的阳性细胞内加入抗癌药物阿霉素,结果大部分肿瘤细胞荧光消失,并且证实失去荧光的肿瘤细胞均已死亡。

随后的体内实验结果也与体外实验一致；
（3）GFP在基因产物及基因定位研究中的应用
GFP在接上各种细胞内定位序列后,在活体中可直接观察各种亚细胞结构及其生活动态,已有大量实验报道表明GFP可定位到细胞核、线粒体、内织网、质膜及核膜孔等〔10,15～19〕。

各种基因突变体的产生(蛋白变小,光强增加)也使得定位在很小区域内的GFP能很灵敏的检
测到。

同样地,利用GFP可以在各种亚细胞结构中表达的特性可以研究某些序列的定位特性及分析定位序列的结构特征等,如Kohler等将酵母细胞色素氧化酶IV亚基的过渡肽序列接上GFP,在植物线粒体中获得了GFP的表达,由此证明coxIV在植物中具有线粒体定位序列的功能。

（4）GFP在分子标记中的应用
作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP 基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

2、如何提高外源基因转染的效率？
可以适当降低转染时细胞的密度（60～70%的密度比90%更好一些），以及细胞的生长状态，在对数生长期内进行才能保证转染效率，因为该时期细胞生长状态良好，容易吸收外源质粒。

但是不同细胞株的对数生长期是有差异的，因此先绘制培养细胞的生长曲线、确定其对数生长期，然后做转染。

3、siRNA抑制基因表达的原理是什么？
研究表明RNA干扰作用既可介导转录后水平的基因沉默也可介导转录水平的基因沉默。

转录后水平的基因沉默主要是调控mRNA特异性的降解过程。

其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。

RNAi也能在转录水平上引导基因的沉默。

其作用机制是由dsRNA降解成的21-23个核苷酸长的siRNA小分子，在细胞核中可以诱导同源序列DNA的甲基化，使靶启动子失去功能，导致下游基因转录沉默。