超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法同时快速鉴定复方延寄参胶囊的化学成分

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法同时快速鉴定复
方延寄参胶囊的化学成分
卢新义;何娟;陈衍斌;杨若瑾;马九太;孙宇宏;孙宝平;程薇薇
【摘要】Objective To determinate the chemical components of Compound Yanjishen Capsules′methanol extracts simultaneously and rapidly by UPLC-Q-TOF-MS in negative ion mode.Methods The methanol extracts of Compound Yanjishen Capusles were prepared by ultrasonic extraction.The study was performed on an ACQUITY UPLCTMBEH
C18column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)with acetonitrile-1mL·L -1formic acid in water as the mobile phase.The main components were separated by gradient elu-tion.The MS detection was performed with ESI source in negative ion mode.The main peaks were assigned.Results In Compound Yanjishen Capsules′methanol extracts,10 ginsenosides were qualitatively identified,including ginsenosides R1,ginsenosides Re, ginsenosides
Rf,ginsenosides Rg1,ginsenosides Rb1,ginsenosides Rd,ginsenosides Ro,ginsenosides Rb2,ginsenosides Ra1and gin-senosides Rg3.3 flavonoids were identified,including neoeriocitrin,naringenin and naringin.3 phenolic acids were identified,inclu-ding fumaric acid,protocatechuic acid and caffeic acid.Conclusion In the study,16 compounds were identified under the same condi-tions by UPLC-Q-TOF-MS.The method has the advantages of high resolution,high efficiency and convenience,and can be used for the chemical components identification of Compound Yanjishen Capsules.%目的采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)法在负离子
模式下对复方延寄参胶囊甲醇提取物的主要化学成分进行快速鉴定.方法超声提取法制备复方延寄参胶囊甲醇提取物,采用ACQUITY UPLCTMBEH C18 (100
mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱为分析柱,以乙腈-1 mL·L -1甲酸水为流动相,进行梯度洗脱分离各主要成分;质谱采用电喷雾离子源,负离子模式下扫描采集数据,对各主要色谱峰进行归属.结果复方延寄参胶囊甲醇提取物中共定性鉴别出以下成分:人参皂苷类化学成分10种,包括三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Ra1和人参皂苷Rg3;黄酮类化学成分3种,包括新北美圣草苷、柚皮素和柚皮苷;酚酸类化学成分3种,包括富马酸、原儿茶酸和咖啡酸.结论采用UPLC-Q-TOF-MS 法在同一条件下共定性鉴别出16种化合物,该方法分辨率高、高效、便捷,可快速准确地鉴别复方延寄参胶囊的化学成分.
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2018(033)002
【总页数】5页(P181-185)
【关键词】复方延寄参胶囊;人参皂苷;化学成分;UPLC-Q-TOF-MS
【作者】卢新义;何娟;陈衍斌;杨若瑾;马九太;孙宇宏;孙宝平;程薇薇
【作者单位】陕西国际商贸学院,咸阳 712000;陕西步长制药有限公司,西安710075;陕西步长制药有限公司,西安 710075;陕西步长制药有限公司,西安710075;陕西步长制药有限公司,西安 710075;陕西步长制药有限公司,西安710075;陕西步长制药有限公司,西安 710075;陕西步长制药有限公司,西安710075;陕西步长制药有限公司,西安 710075
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
冠心病心绞痛是发生在中等动脉中的一种慢性特异性炎症反应[1-2]。

复方延寄参胶囊是由延胡索、人参、骨碎补和北刘寄奴4味中药材制备而成，具有活血通脉止痛、益气强心之功效。

其中君药延胡索，辛苦温、入心肝脾经，具有活血行气止痛的功效；臣药北刘寄奴，苦温，入心经，具有破血通经、散瘀止痛的功效；臣药人参，甘苦温，入心脾经，具有大补元气、益心气、安心神的功效；佐药骨碎补，苦温，亦入心经，具有活血止痛的功效[3-4]。

在药效学研究中，发现复方延寄参胶囊可从多方面对动脉粥样硬化所引起的病理损伤进行修复，缓解所引发的心脏不适症状[5]。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)是一种将色谱的高效在线分离与质谱的高灵敏度、高分辨率完美结合的联用技术，能够准确快速地对药材的化学成分进行定性分析[6-10]。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS法对复方延寄参胶囊甲醇提取物进行全成分分析，通过高分辨质谱分析结合数据库及相关文献对复方延寄参胶囊化学成分进行快速鉴别，旨在为复方延寄参胶囊的药效物质基础研究提供依据。

1 仪器与试药
1.1 仪器 H-Class型超高效液相色谱仪、G2-XSQTOF型质谱仪、Masslynx 4.1工作站(美国Waters公司)；DV215CD型电子天平(德国梅特勒-托利多公司)；KUDOS型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；TDL-5A型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)。

1.2 试药复方延寄参胶囊(陕西步长制药有限公司，批号：1607121，1607122，1607131)；色谱纯甲酸(Sigma公司)；色谱纯甲醇、乙腈(美国Fisher公司)；水
为脱气超纯水。

2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备称取复方延寄参胶囊0.5 g，研细，置于50 mL锥形瓶中，
加入25 mL色谱甲醇，超声(频率53 kHz，功率500 W)30 min后，将混悬液以
5 000 r·min-1离心15 min，取上清液，用色谱甲醇稀释100倍，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，备用。

2.2 色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7
μm)；流速为0.4 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样体积为2 μL；流动相为1 mL·L-1甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序
Tab.1 The gradient elution program
时间/min流动相A/%流动相B/%095557030123070 12.1095515955
2.3 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：1.0 kV；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：800 L·h-1；雾化气压力：35 psi；碎裂电压：135 V；负
离子模式下扫描检测，一级质谱扫描范围：100～1 000 m/z，二级质谱扫描范围：50～1 000 m/z；参比离子设置为m/z 554.261 5。

2.4 数据分析质谱数据采用MassLynx 4.1软件进行峰提取，UNIFI软件进行峰识别，结合Massbank和Human Metabolome Database(HMDB)及相关文献报
道进行结构鉴定。

3 结果
本研究在负离子模式下共定性鉴别出16种化合物，包括人参皂苷类化学成分10种、黄酮类化学成分3种和酚酸类化学成分3种。

复方延寄参胶囊3批样品(批号：1607121，1607122，1607131)醇提物在负离子模式下的总离子流图见图1。

复
方延寄参胶囊(批号1607121)样品醇提物在负离子模式下的总离子流图见图2。

各
化合物的质谱数据见表2。

图1 复方延寄参胶囊(批号：1607121，1607122，1607131)醇提物总离子流图(负离子模式)
Fig.1 The total ion chromatogram of methanol extract of Compound Yanjishen Capsules(Lot:1607121，1607122，1607131)(negative mode)
图2 复方延寄参胶囊(1607121)醇提物总离子流图(负离子模式)
Fig.2 The total ion chromatogram of methanol extract of Compound Yanjishen Capsules(1607121)(negative mode)
3.1 人参皂苷类化学成分解析人参皂苷类在负离子模式下鉴别出人参皂苷类化合物共10种，按照保留时间先后顺序分别是：三七皂苷R1(7)、人参皂苷Re(8)、人参皂苷Rf(9)、人参皂苷Rg1(10)、人参皂苷Rb1(11)、人参皂苷Rd(12)、人参皂苷Ro(13)、人参皂苷Rb2(14)、人参皂苷Ra1(15)和人参皂苷Rg3(16)。

具体解析和归属过程如下：
在负离子模式下，人参皂苷类成分的准分子离子峰为[M+COOH]-及[M-H]-，在二级质谱中，此类化学成分易发生糖苷键的断裂。

对于人参二醇型、三醇型和齐墩果酸型，其裂解途径是糖链取代基的断裂，产生去糖基化离子，普遍产生了
[M+COOH-162]-或[M-H-162]-(失去1个糖苷取代基m/z 162)及[M+COOH-324]-或[M-H-324]-(失去2个糖苷取代基m/z 324)等脱糖基离子。

但由于母核结构不同，该类成分的二级质谱中也产生了一些不同的特征碎片离子，如二醇型
m/z 459，三醇型m/z 475和齐墩果烷型m/z 455等[11]。

表2 复方延寄参胶囊(1607121)醇提物在负离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析结果
Tab.2 Analysis results for the methanol extracts of Compound Yanjishen Capsules (1607121) by UPLC-Q-TOF-MS in negative ion mode
峰号保留时间/min加合物实测值m/z误差/ppm 分子式化合物名称离子碎片10.69[M-H]-115.0033-3.00C4H4O4富马酸115,7121.36[M-H]-
153.01950.90C7H6O4原儿茶酸153,10932.37[M-H]-179.03440.78C9H8O4咖啡酸179,13543.39[M-H]-595.16691.23C27H32O15新北美圣草苷
595,28753.51[M-H]-271.06111.96C15H12O5柚皮素271,15063.76[M-H]-579.1709-0.64C27H32O14柚皮苷579,459,27174.82[M-H]-931.5260-
0.61C47H80O18三七皂苷R1931,799,637,47584.95[M-H]-945.5420-
0.18C48H82O18人参皂苷Re945,783,637,47595.08[M-H]-844.4812-
3.30C42H72O14人参皂苷Rf844,799,475105.29[M-H]-
799.48470.54C42H72O14人参皂苷Rg1799,637,553,475115.99[M-H]-1107.59600.84C54H92O23人参皂苷
Rb11107,945,825,783,621,459126.53[M-H]-945.54290.77C48H82O18人参皂苷Rd945,783,621,459137.23[M-H]-955.49050.35C48H76O19人参皂苷Ro955,793,455147.45[M-H]-1077.5832-1.20C53H90O22人参皂苷
Rb21077,945,915,783,765,459157.72[M-H]-1209.62811.20C58H98O26人参皂苷Ra11209,1047,885,621,459168.29[M-H]-783.48990.68C42H72O13人参皂苷Rg3783,621,609,537,459
化合物7的保留时间为4.82 min，准分子离子峰m/z 931.526 0为 [M-H]-。

在二级质谱中，特征碎片离子m/z 799.482 0为[M-H-xyl]-，特征碎片离子m/z 637.433 4为 [M-H-xyl-glu]-，m/z 475.379 8为 [M-H-xyl-glu-glu]-即皂苷苷元。

结合文献报道[12]，可鉴定为三七皂苷R1。

同理鉴定出化合物8为人参皂苷Re，化合物9为人参皂苷Rf，化合物10为人参皂苷Rg1。

以上4种人参皂苷均
属于人参三醇型皂苷，在二级质谱图中除了具有脱去糖链的碎片离子外，还具有属于人参二醇型皂苷特殊的m/z 475碎片离子,即皂苷苷元。

化合物12的保留时间为6.53 min，准分子离子峰m/z 945.542 9，为 [M-H]-。

在二级质谱图中，出现的碎片离子m/z 783.488 1为[M-H-glu]-，碎片离子m/z 621.438 0为[M-H-glu-glu]-，碎片离子m/z 459.382 9为皂苷苷元。

其裂解符合典型的人参二醇型皂苷裂解规律，结合文献报道[12]，可鉴定为人参皂苷Rd。

同理，鉴定出化合物11为人参皂苷Rb1，化合物14为人参皂苷Rb2，化合物15为人参皂苷Ra1，化合物16为人参皂苷Rg3。

以上5种人参皂苷均属于人参二醇型皂苷，在二级质谱图中除了具有脱去糖链的碎片离子外，还具有属于人参二醇型皂苷特殊的m/z 459碎片离子，即皂苷苷元。

化合物13的保留时间为7.23 min，准分子离子峰m/z 955.490 5为[M-H]-。

在二级质谱中，特征碎片离子m/z 793.435 0为[M-H-glu]-，m/z 455.201 1为皂苷苷元。

结合文献报道[12]，可鉴定为人参皂苷Ro，属于齐墩果烷型人参皂苷，二级质谱图中具有其特征的碎片离子m/z 455.201 1，即皂苷苷元。

人参皂苷类以人参皂苷Rd为例图示二级质谱图、分子结构及裂解途径，见图3。

3.2 黄酮类化学成分解析黄酮类在负离子模式下，共鉴别出3种黄酮类化合物，具体解析过程如下：
化合物4的保留时间为3.39 min，在负离子模式下，m/z 595.166 9为[M-H]-，在二级质谱图中出现的m/z 287.104 2离子峰为糖苷键断裂所产生的碎片离子，结合文献[13]报道，推测该化合物为新北美圣草苷。

化合物5的保留时间为3.51 min，在负离子模式下，m/z 271.061 1为[M-H]-，在二级质谱图中出现的碎片离子峰m/z 150.918 0、m/z 105.012 1为C环发生RDA裂解后所产生的碎片离子，结合文献[13]报道，推测该化合物为柚皮素。

化合物6的保留时间为3.76 min，在负离子模式下，m/z 579.170 9为[M-H]-，
在二级质谱图中出现的m/z 459.002 1碎片离子由C环进行RDA裂解所产生，m/z 271.101 1的碎片离子为糖苷键断裂所产生。

结合文献[13]报道，推测该化合物为柚皮苷。

图3 化合物12(人参皂苷Rd)的二级质谱图、分子结构及裂解途径
Fig.3 The MS2 spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound 12(ginsenosides Rd)
黄酮类化合物以为柚皮素为例图示二级质谱图、分子结构及裂解途径，见图4。

图4 化合物5(柚皮素)的二级质谱图、分子结构及裂解途径
Fig.4 The MS2 spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound 5(naringenin)
3.3 酚酸类化学成分解析酚酸类化合物在负离子模式下，共鉴别出3种化合物，具体解析过程如下：
酚酸类化合物在负离子模式下以[M-H]-形式存在，一般会失去1个羧基产生碎片离子。

化合物1的保留时间为0.69 min，m/z 115.003 3为[M-H]-，在二级质谱图中出现的m/z 71.000 2碎片离子为母核失去1个羧基所产生的碎片离子。

结合文献[14]报道，推测该化合物为富马酸。

化合物2的保留时间为1.36 min，在负离子模式下，m/z 153.019 5为[M-H]-，在二级质谱图中出现的m/z 109.001 2碎片离子为母核失去1个羧基所产生的碎片离子。

结合文献[14]报道，推测该化合物为原儿茶酸。

化合物3的保留时间为2.37 min，m/z179.034 4为[M-H]-，在二级质谱图中出现的m/z 135.012 3碎片离子为母核失去1个羧基所产生的碎片离子。

结合文献[15]报道，推测该化合物为咖啡酸。

酚酸类化合物以咖啡酸为例图示二级质谱图、分子结构及裂解途径，见图5。

图5 化合物3(咖啡酸)的二级质谱图、分子结构及裂解途径
Fig.5 The MS2 spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound 3(caffeic acid)
4 讨论
复方制剂作用的物质基础、作用机制及体内过程是中药研究的核心问题。

复方延寄参胶囊是中药复方大品种，化学成分较复杂，其中什么化合物是在分子层面与“冠状动脉”这个靶点起作用的体内效应物质，它是由什么物质转化而来是急待研究的核心问题。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法在负离子模式下扫描采集数据，UNIFI软件进行峰识别，结合Massbank和Human Metabolome Database(HMDB)及相关文献报道对各主要色谱峰进行归属，从复方延寄参胶囊甲醇提取物中同时鉴别出16种化学成分，包括人参皂苷类10种、黄酮类3种和酚酸类3种。

该方法有高分辨率、高效、便捷的特点，可用于快速分析复方延寄参胶囊的化学成分。

同时，本文的研究结果也为复方延寄参胶囊体内效应物质及其相应药理作用的后续研究提供依据。

在明晰体内效应物质后，其明确的药理作用，将使临床医师在该药物的临床使用中有的放矢，提高合理用药率，也为该药物的质量控制提供依据，提高中药使用的安全性。

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[1] 吴德光.Fas/FasL介导的凋亡及hsCRP在冠心病中的作用研究[D].天津:天津医科大学,2012.
[2] 曲莲莲,陶晶晶,代雅琪,等.银丹心脑通联合瑞舒伐他汀钙对冠心病伴高脂血症患者的疗效[J].西北药学杂志,2017,32(6):775-779.
[3] 李园白,崔蒙,杨阳,等.方剂剂量与君臣佐使关系初探[J].中草药,2015,46(13):2011-2014.
[4] 贺凯,高建莉,赵光树.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展[J].中草药，2007，
38(12):1909-1912.
[5] 赵涛,林玉红,杨娟英.一种用于治疗冠心病心绞痛的药物组合物:中国,CN1698728A[P].2005-5-19.
[6] 孙冬梅,董玉娟,胥爱丽,等.UPLC-Q-TOF-MS法快速筛查银杏磷脂软胶囊中12种黄酮类化合物[J].中成药,2015,37(2):320-324.
[7] 李明潺,王玉丽,郭春宏,等.UPLC-Q-TOF-MS法同时测定平消片中7 种成分[J].中草
药,2015,46(11):1625-1628.
[8] 任晓蕾,霍金海,孙国东,等.短瓣金莲花化学成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中草
药,2015,46(23):3475-3481.
[9] 张定堃,韩雪,李瑞煜,等.UPLC-Q-TOF-MS分析不同产地泥附子化学成分的差异[J].中国中药杂志，2016,41(3):463-469.
[10]胡云飞,裴月梅,吴虹,等.基于UPLC-Q-TOF-MS 技术研究不同产地牡丹皮药材化学成分的差异[J].中草药,2016,47(17):2984-2992.
[11]孟青,钟艳梅,郭晓玲,等.人参中皂苷类成分的快速识别及其质谱裂解规律的初步探讨[J].中药
材,2013,36(2):240-245.
[12]赵静.三七中皂苷类成分的裂解规律探究及其化学特征的道地性研究[D].北京:北京中医药大
学,2015.
[13]彭维,吴万征,邹威,等.原创中药红珠胶囊基于RRLC-ESI-MS/MS技术的化学成分分析[J].中山大学学报:自然科学版,2014,53(4):119-122.
[14]刘杰,许文,李煌,等.UPLC-MS/MS法同时测定白芍饮片中10种成分[J].药物分析杂志，2015，35(4):635-643.
[15]于生,张丽,单鸣秋,等.UPLC-MS法同时测定木瓜饮片中8种有机酸[J].中草
药,2016,47(14):2465-2469.。