生物指示剂的选择
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如试验结果20瓶挑战瓶均呈阴性在计算时可假设只有19只瓶呈阴性因为qnlgnq0代入公式slrbilgn0lgn时数学式无意义则可得出n2303lgnq00513lgn129lgn0slrbilgn11431291014n0101014141010cfu瓶生物指示剂菌液浓度的计算残存曲线法假设f08用d12107的枯草芽孢杆菌计算f0dbilgn011143lgn01043n0101043271010cfu瓶生物指示剂菌液浓度的计算通过以上2种方法计算得出用孢子浓度为的1010cfu瓶d12107的枯草芽孢杆菌的样品来验证灭菌后样品为无菌说明灭菌条件达到f0值大于等于8
生物指示剂菌液浓度的计算（阴性分数法）
假设F0=8，用D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌计算： SLRbi=F0/ Dbi=11.43 （SLR为孢子对数下降值） SLRbi=lgN0-lgN （N0和N分别为灭菌前后孢子数） 根据阴性分数法，N=2.303×lg(n/q)，其中n为挑战性试验 样品总数，q为试验结果呈阴性的瓶数。如试验结果20瓶 挑战瓶均呈阴性，在计算时可假设只有19只瓶呈阴性（因 为q=n，lg(n/q)=0，代入公式SLRbi=lgN0-lgN时，数学式 无意义），则可得出： N=2.303×lg(n/q)=0.0513 lgN=-1.29 lgN0=SLRbi+lgN=11.43-1.29=10.14 N0= 1010.14=1.4×1010(cfu/瓶)
生物指示剂菌种的选择 08年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100℃值为 14.2， 09年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株 D100℃值为16.7。连续两年，车间洁净区最耐热菌 株D100℃值最高为16.7 ，换算成D121℃约为0.12。 因此，我们应该选择D121℃值比0.12大的菌株。 由于菌株的D值受介质影响，因此，我们需要测定 在各介质中的实际的D值，确保生物指示剂适合我 们公司使用。
无菌保证水平计算
SLRS=SLRbi× Dbi/ DS= 66.68 （SLRbi为生物指示剂孢子对数下降值，SLRS为灭菌前产 品中污染微生物对数下降值） SLRS=lgN0-lgN 车间中控微生物标准为＜10cfu/瓶，因此假设N0为10。 lgN=lgN0-SLRS=1- 66.68=-65.68 N=10-65.68 ，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6
法规要求 根据新版GMP征求意见稿内对生物指示剂的说明 “应按供应商的要求保存和使用生物指示剂，并 通过阳性对照和D值测试来确认其质量”。
法规要求 《化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技 术要求》中提到“微生物挑战试验所用生物指示 剂的耐热性及数量应对灭菌工艺构成必要的挑战， 生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的 耐热性。采用过度杀灭法（F0≥12）灭菌工艺的， 可不进行微生物挑战试验。 ”
生物指示剂菌液浓度的计算（残存曲线法）
假设F0=8，用D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌计算： F0/ Dbi=lgN0+1=11.43 lgN0=10.43 N0= 1010.43=2.7×1010(cfห้องสมุดไป่ตู้/瓶)
生物指示剂菌液浓度的计算
通过以上2种方法计算得出，用孢子浓度为的1010(cfu/瓶) D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌的样品来验证，灭菌后样品为 无菌，说明灭菌条件达到F0值大于等于8。
法规要求 CHP2010附录ⅩⅦ灭菌法中涉及生物指示剂的相 关要求 制备生物指示剂用微生物的基本要求： (1)菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能 污染菌的耐受性。 (2)菌种应无致病性。 (3)菌株应稳定。存活期长，易于保存。 (4)易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中 休眠孢子含量要在90％以上。
前言 保证产品无菌是注射剂产品质量保证的核心问题。 在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌） 工艺的效果，SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微 生物残存的概率。 为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定， 采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微 生物存活的概率不得大于百万分之一。 微生物挑战试验（灭菌效力验证）是无菌药品生 产工艺验证的重要环节，目的是证明灭菌后微生 物的残存概率不大于10-6。
生物指示剂选择
菌种
D值
浓度
ATCC7953 嗜热脂肪芽孢杆菌
1.5～3.0
1.0×103 ~1.0×104
ATCC9372 枯草芽孢杆菌
0.3～0.7
1.0×1010
法规要求 CHP2010附录ⅩⅦ灭菌法中涉及生物指示剂的相 关要求 生物指示剂的应用： 在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭 菌条件下的D 值，并测定孢子的纯度和数量。验 证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的 微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有 更大的安全性。
推荐使用的生物指示剂
03版验证指南中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂
菌种名称 嗜热脂肪芽孢杆菌 常规D121℃值/min 1.5～3.0
枯草芽孢杆菌
凝结芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌
0.3～0.7
0.4～0.8 0.4～0.8
CHP2010版中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(如NCTC 10 007、NCIMB8157、 ATCC7953)。D 值为1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子 数5×105～5×106 个，在121℃、19min 下应被完全杀灭 。此外，还可使用生孢梭菌孢子（如NCTC 8594、 NCIMB 8053、ATCC 7955)，D 值为0.4～0.8min。
生物指示剂菌液浓度的计算
若选用D值更高的嗜热脂肪芽孢杆菌计算：(D121℃=1.6) 阴性分数法： lgN0=SLRbi+lgN=F0/Dbi-1.29=8/1.6-1.29=3.17 N0= 103.17=1.5×103(cfu/瓶) 残存曲线法： F0/ Dbi=lgN0+1=5 lgN0=4 N0= 104 (cfu/瓶) 无菌保证水平计算： SLRS=SLRbi× Dbi/ DS= 66.66 lgN=lgN0-SLRS=1- 66.66=-65.66 N=10-65.68 ，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6
生物指示剂菌液浓度的计算（阴性分数法）
假设F0=8，用D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌计算： SLRbi=F0/ Dbi=11.43 （SLR为孢子对数下降值） SLRbi=lgN0-lgN （N0和N分别为灭菌前后孢子数） 根据阴性分数法，N=2.303×lg(n/q)，其中n为挑战性试验 样品总数，q为试验结果呈阴性的瓶数。如试验结果20瓶 挑战瓶均呈阴性，在计算时可假设只有19只瓶呈阴性（因 为q=n，lg(n/q)=0，代入公式SLRbi=lgN0-lgN时，数学式 无意义），则可得出： N=2.303×lg(n/q)=0.0513 lgN=-1.29 lgN0=SLRbi+lgN=11.43-1.29=10.14 N0= 1010.14=1.4×1010(cfu/瓶)
生物指示剂菌种的选择 08年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100℃值为 14.2， 09年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株 D100℃值为16.7。连续两年，车间洁净区最耐热菌 株D100℃值最高为16.7 ，换算成D121℃约为0.12。 因此，我们应该选择D121℃值比0.12大的菌株。 由于菌株的D值受介质影响，因此，我们需要测定 在各介质中的实际的D值，确保生物指示剂适合我 们公司使用。
无菌保证水平计算
SLRS=SLRbi× Dbi/ DS= 66.68 （SLRbi为生物指示剂孢子对数下降值，SLRS为灭菌前产 品中污染微生物对数下降值） SLRS=lgN0-lgN 车间中控微生物标准为＜10cfu/瓶，因此假设N0为10。 lgN=lgN0-SLRS=1- 66.68=-65.68 N=10-65.68 ，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6
法规要求 根据新版GMP征求意见稿内对生物指示剂的说明 “应按供应商的要求保存和使用生物指示剂，并 通过阳性对照和D值测试来确认其质量”。
法规要求 《化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技 术要求》中提到“微生物挑战试验所用生物指示 剂的耐热性及数量应对灭菌工艺构成必要的挑战， 生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的 耐热性。采用过度杀灭法（F0≥12）灭菌工艺的， 可不进行微生物挑战试验。 ”
生物指示剂菌液浓度的计算（残存曲线法）
假设F0=8，用D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌计算： F0/ Dbi=lgN0+1=11.43 lgN0=10.43 N0= 1010.43=2.7×1010(cfห้องสมุดไป่ตู้/瓶)
生物指示剂菌液浓度的计算
通过以上2种方法计算得出，用孢子浓度为的1010(cfu/瓶) D121℃=0.7的枯草芽孢杆菌的样品来验证，灭菌后样品为 无菌，说明灭菌条件达到F0值大于等于8。
法规要求 CHP2010附录ⅩⅦ灭菌法中涉及生物指示剂的相 关要求 制备生物指示剂用微生物的基本要求： (1)菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能 污染菌的耐受性。 (2)菌种应无致病性。 (3)菌株应稳定。存活期长，易于保存。 (4)易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中 休眠孢子含量要在90％以上。
前言 保证产品无菌是注射剂产品质量保证的核心问题。 在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌） 工艺的效果，SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微 生物残存的概率。 为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定， 采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微 生物存活的概率不得大于百万分之一。 微生物挑战试验（灭菌效力验证）是无菌药品生 产工艺验证的重要环节，目的是证明灭菌后微生 物的残存概率不大于10-6。
生物指示剂选择
菌种
D值
浓度
ATCC7953 嗜热脂肪芽孢杆菌
1.5～3.0
1.0×103 ~1.0×104
ATCC9372 枯草芽孢杆菌
0.3～0.7
1.0×1010
法规要求 CHP2010附录ⅩⅦ灭菌法中涉及生物指示剂的相 关要求 生物指示剂的应用： 在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭 菌条件下的D 值，并测定孢子的纯度和数量。验 证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的 微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有 更大的安全性。
推荐使用的生物指示剂
03版验证指南中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂
菌种名称 嗜热脂肪芽孢杆菌 常规D121℃值/min 1.5～3.0
枯草芽孢杆菌
凝结芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌
0.3～0.7
0.4～0.8 0.4～0.8
CHP2010版中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(如NCTC 10 007、NCIMB8157、 ATCC7953)。D 值为1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子 数5×105～5×106 个，在121℃、19min 下应被完全杀灭 。此外，还可使用生孢梭菌孢子（如NCTC 8594、 NCIMB 8053、ATCC 7955)，D 值为0.4～0.8min。
生物指示剂菌液浓度的计算
若选用D值更高的嗜热脂肪芽孢杆菌计算：(D121℃=1.6) 阴性分数法： lgN0=SLRbi+lgN=F0/Dbi-1.29=8/1.6-1.29=3.17 N0= 103.17=1.5×103(cfu/瓶) 残存曲线法： F0/ Dbi=lgN0+1=5 lgN0=4 N0= 104 (cfu/瓶) 无菌保证水平计算： SLRS=SLRbi× Dbi/ DS= 66.66 lgN=lgN0-SLRS=1- 66.66=-65.66 N=10-65.68 ，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6