发酵工艺学实验

配制培养基
• （1）制备平板分离培养基： 葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母抽提物 10g，琼脂 20g，水 1000 mL。 灭菌115℃，20min。每三角瓶分装100mL，灭菌后 倒平板。 • （2）制备斜面保藏培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母抽提物 10g，琼脂 20g， 水 1000mL。 灭菌115℃，20min。每试管分装5mL，灭菌后摆斜 面待用。 • （3）制备种子培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g， 酵母抽提物 10g, 水 1000mL。灭菌115℃，20min。 每三角瓶分装30mL，灭菌待用。
双酶法制备淀粉糖
• 酶法糖化投资少，工艺稳定，对设备要求 也不高，产品质量好，消耗小，收率高， 条件温和，对环境影响小。
三、试验材料
• 玉米淀粉、液化型α-淀粉酶（酶活力6000 单位/g），糖化酶（葡萄糖淀粉酶、酶活 力为4-5万单位/g），10%NaOH, 5%Na2CO3, 5%CaCl2。 • 500ml烧杯，pH试纸、秒表，玻璃棒，恒 温水浴锅，电炉，石棉网、温度计、恒温 水浴、手持糖度仪（可溶性固形物）。
倍数B
（三）实验器材
1.菌种
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬 液
2.器具
显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌 水、吸管、盖玻片、计数器。
（四）实验方法
1.稀释
将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，
可不必稀释。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若
培养基的配制
培养基的制备过程 称量---溶解----调节pH值----过滤---分装及包扎----灭菌----灭菌后试管 摆放斜面
• 1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 • 配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂 20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 • （蛋白胨易吸潮，称蛋白胨时速度要快。 • 牛肉膏难溶，称量后可提着称量纸一角，在热 的培养基里溶解。）
糖化是指利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解， 转变为葡萄糖的过程，在生产上称为“糖化”。
DE值
• DE值(Dextrose Equivalent)即葡萄糖值， 用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的 是葡萄糖占干物质的百分率，即：
还原糖% DE值 100% 干物质%
二、实验原理——淀粉的糖化
• 2.溶解 • 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。 如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌， 并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补 足所失水分。 • • 3.调节pH值 • 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节 PH。
• 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。
在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一)，其含 义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分 25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2 表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是 1/400 mm2。 计数室通常也有两种规格： 一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又 分为25小格； 另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格 又分为16小格。 但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特 点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组 成。
淀粉 水解 葡萄糖，才能被酵母菌利用。
许多微生物不能直接利用淀粉，除分泌胞外淀粉酶微生物外。
酸解法
酶解法 酸酶法 酶酸法
酸酶（或酶酸）结合法
淀粉糖化的方法
1.酸解法 淀粉 酸 高温高压 葡萄糖 2.酶解法（双酶法） 淀粉 a-淀粉酶 糊精和低聚糖 糖化酶 葡萄糖 (液化) （糖化） 3.酸酶法 淀粉 酸解法 糊精和低聚糖 糖化酶 葡萄糖 4.酶酸法 淀粉 a-淀粉酶 糊精和低聚糖 酸解法 葡萄糖
Wheat starch
Potato starch
糖 化 中 的 淀 粉 分 解
淀粉的糊化、液化、糖化
糊化是指淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后 淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性 的淀粉糊，这一过程称为糊化。简而言之，糊化 就是淀粉颗粒在热溶液中膨胀破裂的过程。 液化是指利用液化酶将糊化淀粉水解成糊精和低 聚糖小分子等，使粘度降低，流动性增高。
注 意 事 项
1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速； 2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好 的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免 琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高 的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶 体的1/2 ；
发酵工艺学实验
实验一 双酶法制备淀粉糖
• 一、 实验目的 • 1、了解淀粉糊化及酶法制备淀粉糖浆的基 本原理。 • 2、掌握淀粉双酶法制备淀粉糖浆的实验方 法，以及酶的使用。
淀粉的组成
• 由D-葡萄糖单体组成的同聚物。包括直链淀粉（α1,4-糖苷键）和支链淀粉两种类型。（α-1,4-糖苷键， α-1,6-糖苷键 ）
5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞 而引起污染。
返 回
• 2、平板分离 • 称取0.1g即发性干酵母，转移至无菌水试管，振 荡5min，制成菌悬液。划平板，30℃培养2d。 • 用接种环沾取单菌落，划斜面，30℃培养30h。
• 3、种子培养 • 无菌条件下，用接种环挑取斜面上菌落，接种至 种子培养基。30℃，150r/min，培养30h。血球 计数板测种子培养液中酵母菌体密度。
（三）平板划线分离法
交叉划线法
连续划线法
实验二
微生物数量的测定
（二）实验原理
• （一）实验目的
• （三）实验器材
• （五）实验作业
（四）实验方法
直接计数法
（一）实验目的
1、了解显微镜计数的原理；
2、学习并掌握使用血球计数板进行微生 物直接计数的方法。
（二）实验原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微
四、方法和骤
• 1、双酶法生产淀粉糖浆工艺流程 50g淀粉（加水 200ml，搅拌均匀）——淀粉浆——5%碳酸钠调节 pH≈6.2-6.3——2ml 5%CaCl2溶液——85-90℃水浴 上加热（不断搅拌）——淀粉糊化——加入液化型α淀粉酶60mg（不断搅拌）——液化——70-80℃搅 拌20分钟，（取样分析DE值——至电炉（隔石棉网） 加热到95℃至沸，灭活10分钟——过滤，滤液冷却 至55℃——加入糖化酶200mg——调节pH≈4.5, 于 60-65℃恒温水浴中糖化3-4小时，（3小时取样分析 控制DE≈42）即为淀粉糖浆。 • 2、检测 用手持糖度计测定，直接读取固形物含量。
生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方
法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的
生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。
由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称 为总菌计数法。
血球计数板是一块特制的
载玻片，其上四条纵槽构成 了三个平台，中间的平台又 被一短横槽隔成两半，每一 边的平台上各刻有一个方格 网，每个方格网共分成9个 大方格，中央的大方格为计 数室。计数室边长1mm，共 有400个小方格，加盖玻片 于突起部分上时，即形成一 个体积为0.1mm3的计数室。 即1mm×1mm×0.1mm方格的 计数板。
1．16×25型的计数板 含16中格，每中格有25个小格， 一般取四角：1、4、13、16四个中方格（含100个小方格） 计数计数重复3次，取其平均值。 1ml 菌 液 中 的 总 菌 数 = 100 个 小 方 格 细 胞 总 数 A/ 100 ×400×10 × 1000×稀释倍数B， 或计数总数A／4×16×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×4×10000×稀释
分装及包扎?分装量根据试管大小和实际需要而定固体培养基装量约为管高的15斜面长度约为管长度的12液体培养基的装量约为管高的14三角瓶的装量不超过瓶体积的12固体培养基装量约为管高的15斜面长度约为管长度的12液体培养基的装量约为管高的14三角瓶的装量不超过瓶体积的12?根据不同的需要可将制好的培养基分装入试管内用分装漏斗或三角瓶内管瓶口塞上硅胶塞棉塞或试管帽
5.清洗血球计数板
计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干 或用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。
注意事项 1、 每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球 计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7 天。 2、 从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管 轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵 母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得 的培养液中的酵母菌数量误差小。1、加样时先 摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生； 3、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时， 作为两个菌体计算； 4、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。
（3）糖化过程中DE值的变化
DE 值
糖化时间
实验二、面包酵母活化和种子液培养
主要实验内容： 1、配制培养基： 平板分离培养基，斜面活化与保藏培养基，液体种子培养基。
2、酵母菌的分离：平板划线分离法；
3、酵母菌的活化培养与保藏。
试验材料
• 面包酵母、葡萄糖、酵母浸膏、牛肉膏、 氯化钠、 • 试管（10×150mm）、培养皿、烧杯 （500mL）、锥形瓶（300mL）、接种环、 酒精灯、牛皮纸、pH试纸、恒温摇床、培 养箱、离心机、生物安全柜、血球计数板、 光学显微镜、盖玻片
5、 对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相 邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线， 数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计 数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对 角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即 100个小格)的酵母菌数；如果规格为25格×16格的 计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央 的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。 6、 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数 值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌 体。按公式计算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵 母菌个数。
倍数B
2．25×16型的计数板含25中格，每中格有16个小格。一 般计数四个角和中央（1 、5、13、21、25）的五个中方 格（含80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均 值。 1ml菌液中的总菌数 ＝80个小方格细胞总数A/ 80 × 400×10 ×1000 ×稀释倍数B， 或计数总数A／5×25×10×1000×稀释倍数B。即计数总数A×5×10000×稀释
CH2OH OH O OH CH2OH OH O OH O O OH CH2OH OH O O OH O O OH CH2 OH O O OH CH2OH OH O O CH2OH OH O O a-1，6糖苷键
a-1，4糖苷键
淀粉颗粒
• 麦芽、辅料中的淀粉，一般由细胞壁包围， 以颗粒状存在。这种颗粒不溶于水，也不 受淀粉酶的作用。
7. 灭菌后试管摆放斜面
• 6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。
高压灭菌锅的使用注意
• 灭菌前先加水淹没电热圈，不能干烧。 • 两个阀门：安全阀（一般不动），蒸汽阀 • 灭菌条件：0.103 MPa，1210C维持20分钟，杀死所 有芽孢。 • （饱和水蒸气时，温度与压力成正比，1010C时关 闭蒸汽阀，排原来锅内的冷空气。否则温度达不 到所需温度，影响灭菌效果。） • 压力降到0 MPa，温度900C以下，打开蒸汽阀排气 后，再打开灭菌锅。 • 分装时注明灭菌日期，灭菌后一般可保留l～2周。
有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无
菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片
边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛 细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能 充满菌液。注意不可有气泡产生。
4.显微镜计数
静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找 到计数室，再换成高倍镜进行计数，一般以每小格5— 10个菌体为宜；每个计数室选右上右下、左上左下和 中间的五个中方格中的菌体进行计数，每个样品重复 计数两次
• 5.分装及包扎
• （分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培 养基装量约为管高的1/5，斜面长度约为管长度的 1/2，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶 的装量不超过瓶体积的1/2 ）
• 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管 内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上 硅胶塞 (棉塞或试管帽)。最后用牛皮纸将棉塞部 分包好。（作用：防止棉塞或纱布被冷凝水打湿 而降低过滤微生物的效果，防止加热时棉塞或硅 胶塞蹦出） • 用于摇瓶培养时要用8层纱布包，再用牛皮纸包， 灭菌，培养时去掉牛皮纸，只留纱布。