蛋白质水解度的简易测定方法_袁斌

文章编号:10083464(2002)02011303
蛋白质水解度的简易测定方法
袁斌1
,吕桂善2
,刘小玲
2
(1深圳市成业冷冻有限公司,广东深圳518019;2广西大学生物技术与糖业工程学院,广西南宁530004)
摘要:介绍了一种比较简单可行的蛋白质水解度的测定方法,该方法基于国外通用的pH ST A T 法,不需要特别的仪器,化学试剂耗量少,测定结果可靠,便于实验室和工业化生产使用。

关键词:蛋白质;水解度;pH ST A T 法中图分类号:T Q 936.1 文献标识码:A
The simple method of determining for the degree of
hydrolysis of proteins
YU ANG Bin 1,LU Gui shan 2,LIU Xiao ling
2
(1Shenzhen Cheng ye Freeze Cor por ation Limited,Shenzhen 518019,China;
2Biotechnolog y and Sug ar Engineering Colleg e ,Guangx i U niv .,Nanning 530004,China )Abstract :A simple and w orkable method ,w hich w as based o n pH STAT method ,fo r deter-mining the deg ree of hydr olysis o f pro tein ,was intr oduced in the present paper.This metho d can be used in lab and food industry w ith g ood results and little reagents consumptions.
Key words :pro tein;deg ree of hydr olysis;pH ST AT Method
蛋白质是人体必不可少的营养素,在人体的代谢和生长过程中起着十分重要的作用。

但由于不同的蛋白质其氨基酸组成与空间结构不同,在人体内的消化吸收率也大不相同。

当蛋白质被水解为小肽和游离氨基酸后,其吸收利用率大为增加。

因此,为了充分地利用好这些蛋白质资源,对蛋白质进行水解是十分必要的。

但如果蛋白质水解过度,会导致水解产物出现苦味,严重影响到产品的质量和风味。

因此,对蛋白质进行有限水解非常重要。

为了使水解达到预定的要求,就必须对蛋白质的水解度进行有效的测定。

所谓蛋白质的水解度(Deg ree of hydro lysis,DH )是指蛋白质中的肽键被水解的百分数,其计算公式为:
DH %=h /h tot ×100%
其中,h 即是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数(m mol /g 蛋白质),而h tot 则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数。

对于某一特定的蛋白质,该值是一个常数。

但由于蛋白质中的肽键的数目没法精确的测出,而且不同的蛋白质其肽键的含量也不同,因此,一般根据文献取一个经验值,对于酪蛋白,h tot 值为8.2mm ol/g 蛋白质。

第21卷　第2期V ol.21,No.2
广西农业生物科学Jo ur nal o f Guangx i Ag ric.and Bio l.Science 2002年6月　June,2002　
收稿日期:20010818
基金项目:作者简介:袁斌(1973深圳市成业冷冻有限公司助理工程师;通讯联系人为吕桂善。

114广西农业生物科学第21卷　
很显然,当蛋白质中的肽键全部被水解生成游离的氨基酸时,则水解度为100%;没有被水解时,其水解度为0。

由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就新生成一个-NH2和一个-COOH基,因此,在测定蛋白质的水解度时,只要定量的测定新生成的-NH2和-COOH基的量就可以计算出h值,这样就可以算出蛋白质的水解度来。

常见的蛋白质水解度的测定方法有三硝基苯磺酸法(T NBS)[1],甲醛固定法,茚三酮法[2],三氯乙酸法和pH STA T法[3]。

在上述几种方法中,国内通常采用甲醛固定法和茚三酮法。

对于茚三酮法,由于比色测定时读数不稳定,很难读出一个准确的数值;而且它采用单一氨基酸作为标准,而不同的氨基酸对茚三酮的显色度有偏差,因此所得的结果不够准确[4]。

甲醛固定法操作相对简单,但结果偏低。

对于T NBS法,测定结果相对可靠,但测定用试剂不容易买到[2,4]。

因此,国外常用pH ST AT法。

但由于pH STAT法需要特别的仪器,普通的实验室没有这一整套设备,因此,国内很少采用这种方法进行水解度的测定。

本文即介绍一种实用、简便的pH STAT变通法。

1　材料与方法
1.1　实验材料
酪蛋白的制备:取1kg的鲜牛乳,脱脂后用6m ol/L的HCl调至pH4.6,使酪蛋白沉淀, 4000r/m in离心15min,将沉淀和乳清分开。

水洗酪蛋白沉淀,使其pH为中性,离心去掉上清液,将沉淀冷冻干燥,即得酪蛋白。

1.2　化学试剂
胰蛋白酶(T rypsin,Gibco公司生产,活力单位1∶250),20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.10),
0.5mo l/L的NaOH等。

1.3　酪蛋白的水解
准确称取1.0000g的酪蛋白,用25mL20m mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.10)溶解,调节其pH为7.0,加入100m g胰蛋白酶,混匀,置于50℃的水浴锅中进行水解,经过一定反应时间,需要终止反应时,将反应体系加热到100℃,保持5m in,将酶失活,即可终止反应。

1.4　经典pH ST AT法测定蛋白质水解度
采用经典的pH ST AT法[3]测定蛋白质的水解度时,利用pH自动控制仪实时对反应体系的pH 值进行在线控制,以维持反应体系恒定的pH。

1.5　本文简易法蛋白质水解度(DH%)的测定
水解度的测定按照pH STAT法[3],有改动。

采用本方法测定蛋白质水解度时,不需要象经典的pH ST AT法那样,对反应体系的pH值进行在线控制,而只需在水解结束后将反应体系的pH调至7.0,并记录下所用的碱液的量即可。

具体方法如下:水解开始时,调节反应体系的pH为7.0,反应结束后测定反应体系的pH值,用0.5mol/L的NaOH将反应体系的pH调到原来的pH,记录下所用的碱液的量,按下式即可计算出酪蛋白的水解度[3]:水解度DH%=B(Mb)(1/ )(1/MP)(1/h tot)×100
其中:B为NaOH的体积(mL);M b为NaOH的浓度(m ol/L);在pH7.0,50℃的实验条件下,对于酪蛋白,1/ 为2.26;M P为蛋白质的质量(g);h tot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数,对于酪蛋白,该值取8.2。

2　结果与讨论
(1)两种方法结果对比。

为了验证本测定方法的可靠性,进行了酪蛋白的水解实验,分别用经典的pH ST AT法和本实验的简易方法对酪蛋白的水解度进行测定,结果见表1。

从表1中结果可以看出,用pH STAT法与本文所述简易法测定的结果没有显著的差异。

(2)酪蛋白水解进程研究。

为了研究不同的水解反应,尤其是长时间的水解反应,是否可以同样应用这种方法进行水解度的测定,本文还对酪蛋白的水解进程进行了研究,具体结果见表2。

结果表明,
在不需要进行恒定pH 值水解时,可以用本方法进行水解度的测定。

事实上,在水解过程中,通过pH STA T 法进行水解度的测定可以知道,对于大多数的蛋白质酶法水解反应,酶的水解作用主要发生在刚开始的1h 内,过后其水解作用逐渐下降(见表2),所以一般的水解反应都可以用本方法进行测定。

(3)考虑到某些长时间的水解反应(如水解16～24h),如果水解时pH 下降太快,导致体系的pH 过低,有可能影响到蛋白酶的活性,这时不宜采用本方法进行测定,而只能用pH STAT 法或其它方法进行测定。

表1　酪蛋白水解度的测定结果
Table 1　The determination of the degree of hydrolysis of casein
方法M ethod
开始时pH Beg inning pH value
终止时pH T erm inatio n
pH v alue 添加0.5mo l ・L -1N aO H 的量/ L
V olume of 0.5mol ・L -1N aOH
水解度/%Degr ee of hy dr oly sis
经典pH
ST A T 法pH
ST A T metho d
7.07.0105014.47本文简易法Simple w ay in the pr esent paper
7.0
6.20
1040
14.33
注:反应时间为240min 。

N ote :T he tota l hydr olysis time was 240min .
表2　酪蛋白水解进程参数记录
Table 2　The parameters of casein hydrolysis process
项目Item
方法M ethod 时间T ime/min 306090120150180210240pH 值pH v alue
A 7.007.007.007.007.007.007.00　7.00
B 6.57
6.34
6.32
6.32
6.32
6.32
6.33
6.34加碱量/ L
A 950.00V o lume of 0.5mol ・L -1N aO H
B 1000.00水解度/%
A 13.09D eg r ee of hydr olysis
B
13.78
注:A 为用经典的pH ST AT 法测定酪蛋白水解度,B 为每隔30m in 测一次pH 值,到反应结束后再加碱调节pH 到7.0的方法测定酪蛋白水解度。

N ote :A denot es t he t ypical pH
ST A T metho d ;B denot es t he simple w ay used in t he pr esent paper .
3　小　结
本文在pH ST AT 法的基础上通过变通,提出了一种简单易行的蛋白质水解度的测定方法,适应于不需要恒定pH 的水解反应。

本方法不需要操作者随时守着水解反应体系,记录水解时pH 的变化并保持一个恒定的pH 值,只需要在水解结束时测定一下反应体系的pH 值,并调节到原来的pH 值即可,因此本方法较之pH ST AT 法要简单易行。

可适用于实验室及食品工业生产线上需要控制蛋白质水解程度的DH %的检测。

参考文献:
[1]　AD LER
NI SSEN J.Deter mination of the deg ree o f hy dr olysis o f food pro tein hydro ly sates by T r initr oben-zenesulfonic A cid [J ].J A gr ic F ood Chem ,1979,27:1256～1262.
[2]　赵新淮,冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定[J ].食品科学,1994,11:65～67.
[3]　A DL ER N ISSEN J.Enzy matic Hydro ly sis o f Fo od P ro teins [M ].L o ndon:Elsevier A pplied Science Publisher s,
1986.12～14.
[4]　郭兴凤.蛋白质水解度的测定[J ].中国油脂,2000,25(6):176～177.
(责任编辑　梁健)
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第2期袁斌等:蛋白质水解度的简易测定方法。