喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析

第21卷第2期分析测试学报VoI.21No.2
2002年3月FENXI CESHI XUEBAO(JournaI of InstrumentaI AnaIysis)Mar.2002
喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析
阎秀峰，王洋，于涛，张玉红，殷丽君
（东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室，黑龙江哈尔滨150040）
摘要：建立了一种简便、快速、准确的喜树叶片中喜树碱含量的高效液相色谱分析方法；采用英国HPLC TechnoIogy公司的Techsphere ODS柱（25cm X4.6mm ID，5!m），流动相乙腈-水（体积比416），流速1.0 mL·min-1，检测波长254nm，柱温25C，进样量10!L；样品制备方法以61!（!）乙醇为溶剂，50C下超声提取喜树叶粉10min；HPLC法测定喜树碱的含量；该法的RSD为2.5!（I=6），平均回收率为96!。

关键词：高效液相色谱法；喜树；叶片；喜树碱
中图分类号：@946.88；@949.761.8文献标识码：A文章编号：1004-4957(2002)02-0015-03
喜树碱（camptothecin，CPT）是我国特有树种喜树（Camptotheca acumiIata Decne.，珙桐科）中所含的一种生物碱[1]，具有显著的抗肿瘤活性，其抗癌机理独特，是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶"发挥细胞毒性的天然植物活性成分[2]，目前已有TPT、CPT-11等喜树碱类药物（喜树碱衍生物）获得美国FDA批准用于临床治疗癌症。

喜树中的喜树碱含量很低，一般仅为0.01!~0.1!，很多研究工作集中在探求高喜树碱含量的喜树原料上[3,4]，但对喜树碱含量的测定方法尤其是供试样品的制备方法则很少深入探讨。

已有的喜树碱含量测定方法中均以甲醇或乙醇浸提数次的方法来提取喜树碱[3~5]，提取时间长，且不易提取完全。

本文系统地探讨了高效液相色谱法测定喜树叶中喜树碱含量的样品制备方法，提出了将原料保存于提取液体系中一次超声提取以获得待分析样品的技术路线，建立了一种简单、快速、可靠的喜树碱含量分析方法。

1实验部分
1.1仪器与试剂
JASCO高效液相色谱仪，1580泵，1575型紫外检测器，Version6.1色谱工作站。

喜树碱标准品由美国The StehIin Foundation for Cancer Research提供，纯度99.0!；用于探讨样品制备方法的喜树叶采自东北林业大学实验林场栽培的3年生喜树幼树，用于分析的喜树叶样品采集自我国各喜树产地。

1.2色谱条件
英国HPLC TechnoIogy公司的Techsphere ODS柱（25cm X4.6mm ID，5!m），流动相为乙腈-水（体积比416），流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温25C，进样量10!L。

1.3标准溶液的配制
精密称取喜树碱标准品7.0mg于100mL的容量瓶，以乙腈-水（体积比416）为溶剂超声溶解并定容至刻度，摇匀备用。

1.4样品制备方法
精密称取喜树叶粉4g于100mL容量瓶，加入90mL61!（!）的乙醇，50C下超声提取10min，冷却至室温，稀释至刻度。

取1mL提取液，12500g离心10min，吸取上清液10!L进样。

2结果与讨论
2.1检测波长的确定
以乙腈为空白，在200~400nm对一定含量的喜树碱乙腈溶液的紫外吸收进行扫描，喜树碱在254nm处有强吸收（图1），因此选择254nm作为紫外检测器的检测波长。

2.2流动相的选择
分别以不同比例的乙腈-水为流动相进样分析表明，流动相乙腈-水体系在体积比317~41
收稿日期：2001-04-19；修回日期：2001-10-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30070086）；黑龙江省留学归国基金资助项目（L00C009）
作者简介：阎秀峰（1965-），男，黑龙江肇东人，教授，博士；殷丽君，现为中国农业大学食品学院博士后.
图l 喜树碱标准品紫外吸收谱
Fig.l UV absorbance curve of CPT standard in
acetonitriie
图2标准品（A ）和喜树叶样品（B ）色谱图Fig.2Chromatograms of standard (A )and sampie of
ieaves of Camptotheca acuminata Decne.(B )
l6分析测试学报第2l 卷
6之间时喜树碱的保留时间为4.8min ~8.7min ，峰形良好且可保证提取样品的喜树碱与相邻组分良好分离（图2），理论塔板数按喜树碱峰计算不低于3000，喜树碱峰与相邻峰的分离度大于l.5。

为了提高分析速度，本法选择了体积比416的乙腈-水作为流动相。

2.3标准曲线的绘制
分别精密吸取喜树碱标准溶液0.l 、0.5、l.0、2.0、5.0、8.0mL 于l0mL 容量瓶中，以乙腈-水（体积比416）为溶剂定容、摇匀。

按照上述的色谱条件，分别取稀释后样品及原标准溶液进样分析。

喜树碱质量浓度（Y /（mg ·L -l ））与峰面积（X ）的线性回归方程为：Y =4.938X l0-4X -0.395l ，r =0.9999，线性范围0.70~70mg ·L -l 。

2.4样品制备方法的确定
2.4.1提取溶剂的筛选分别以95!乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿作为溶剂超声提取喜树碱，结果表明，95!乙醇的提取效果最佳。

2.4.2提取方法的比较分别采用3种提取方法制备样品：（l ）称取4g 样品于l00mL 容量瓶中，加入90mL 95!乙醇超声提取30min ，冷却定容，取样离心，进样分析；（2）称取4g 样品于锥形瓶中，30mL 95!乙醇超声提取3次，每次30min ，合并提取液于l00mL
容量瓶中，95!乙醇定容至刻度，取样离心，进样分析；（3）称取4g 样品，95!乙醇索氏提取6h ，定容于l00mL 容量瓶，取样离心，进样分析。

经差异显著性分析，3种方法制得的样品分析结果差异不显著，l 法的结果略高于2法及3法。

作者认为，造成这一结果的原因可能是：（l ）在l 法的提取条件下获得的是喜树碱稀溶液，可以达到组织外溶液及组织内液体的浓度平衡，因而尽管未达到一般意义上的“提取完全”，但在此条件下组织内液体也是提取液的一部分，并不影响分析结果；（2）2法在多次反复提取的处理过程中不可避免造成少量损失，而3法则需使提取液较长时间处于较高的温度下，易于造成植物提取样品的变化。

而且，l 法操作简便，尤其是处理大批样品时，更具有2法及3法所无法比拟的优越性，因而本法采用了l 法。

2.4.3最佳提取条件选择乙醇含量、提取时间及提取温度进行3因素l0水平U l0
（l03）均匀设计试验，试验条件及结果见表l 。

表l U l0（l03）均匀设计试验条件及结果（偏差值0.l944）Tabie l U l0（l03
）experimentai conditions and resuits by uniform design (deviation 0.l944)
No Content of aicohoi
Extraction temperature
Extraction time
Yieid of CPT Fitted vaiue
Residuai vaiue
!/!"/C t /min R /!
!!l
l060600.042410.00l 40.04240.000022025l200.042710.00l 30.04270.000l 33050l600.048210.00l 50.0484-0.000244030400.053910.00l 60.05370.000255035200.060810.00l 20.06l 2-0.0004660l52000.052210.00l 30.0523-0.000l 77045l000.059l 10.00l 60.05870.000488020l400.04l 010.00080.04090.000l 99055800.053310.00l 60.0534-0.000l l0
l00
40
l80
0.024810.0007
0.0249
-0.000l
第2期阎秀峰等:喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析17
表2不同省份喜树叶中喜树碱含量
TabIe 2Content of CPT in Ieaves of Camptotheca
acuminata Decne.in different provinces
No Province Content of CPT w /!Tender Ieaves Grown Ieaves 1Guizhou (贵州)0.06760.03272Sichuan (四川)0.10680.05133Guangxi (广西)0.16940.05454Yunnan (云南)0.07030.02055
Henan (河南)
0.09390.0494
对试验结果进行逐步回归分析（引入变量F -检验值F 1=0.05，剔除变量F -检验值F 2=0.05），得回归方程：
Y =-0.02135185+0.00125135!+0.00163838"+0.00024970t -0.00001156!2+
0.00000322!"-0.00000132!t -0.0109125"
2
-0.00000631"t ,回归方程的复相关系数r =0.9998，残差标准差S =0.00065，残差平方和SE 为0.00001，本方程对试验结果拟合较好。

对回归方程中各项的偏回归系数分析结果表明，在选定试验条件下乙醇含量对喜树碱的提取率有显著影响，而提取温度及提取时间对提取结果影响不显著。

根据回归方程，最佳乙醇含量为61!（!）
，最佳提取温度为50C ，最佳提取时间为实验最小设定值20min 。

为了更准确地反映提取时间对喜树碱提取率的影响，进行了补充试验：在最佳乙醇含量和提取温度下，分别超声提取样品1、2、3、4、5、10、15、20、25及30min ，并进样分析。

结果表明，在1~10min ，喜树碱提取率随提取时间的延长而提高;10min 后，提取率随提取时间的延长而略有降低，但在提取时间为5~20min 间，所有提取样品的RSD 为3.6!，说明在此条件下，
提取时间为5~20min 时喜树碱的提取率基本稳定，选择的提取时间为10min 。

因此，喜树碱最佳提取条件为：乙醇含量61!，提取温度50C ，提取时间10min 。

2.5干燥方法
采集一定数量的喜树鲜叶，以叶脉为中线将喜树叶对称分为2份，分别采用80C 干燥至恒重及冻干至恒重的方法干燥，干燥后置于同一干燥器中保存1周。

分别按上述方法制备分析样品，结果表明冻干样品的喜树碱含量高于烘干样品。

因此，分析喜树碱含量时，在实验条件许可的情况下应采用冻干的方法来处理样品。

2.6回收率测定
精密称取6份喜树叶粉，每份2g ，分别加入喜树碱标准品1.2mg ，按1.4方法制备样品，测得加标回收率为96!。

2.7精密度
精密称取6份喜树叶粉，每份4g ，按1.4方法制备样品，测定喜树碱含量，RSD 为2.5!。

2.8样品分析
采用上述方法对采自不同省份的喜树嫩叶及成叶进行了喜树碱含量分析（表2）。

由于试验条件限制，用于分析的喜树叶采用80C 干燥至恒重的方法。

传统喜树碱生产均以果实为原料。

从上述测定结果可以看出，喜树嫩叶的喜树碱含量也较高，显著高于成叶。

广西产喜树嫩叶的喜树碱含量达0.17!，甚至高于喜树果实的喜树碱含量[5,6]。

因此，喜树嫩叶亦可作为生产喜树碱的原料，而且易于采收且不受树龄限制。

测定的喜树叶片中，广西产喜树嫩叶及成叶喜树碱含量均高于其他各省，质量最佳。

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第21卷第2期分析测试学报
VoI.21No.22002年3月FENXI CESHI XUEBAO (JournaI of InstrumentaI AnaIysis )Mar.2002
Determination of Camptothecin in Leaves of
Camptotheca Acuminata Decne.by HPLC
YAN Xiu-feng,WANG Yang,YU Tao,ZHANG Yu-hong,YIN Li-jun
(Open Research Laboratory of Forest PIant EcoIogy ,Northeast Forestry University ,Haerbin 150040,China )
Abstract ：A simpIe,rapid and sensitive method for the determination of camptothecin in Ieaves of Camptotheca acuminata Decne.was estabIished.Camptothecin in the Ieaves was uItrasonicaIIy extracted with 61!aIcohoI at 50C for 10min,and determined by high performance Iiguid chromatography.The camptothecin was separated on a Techsphere ODS coIumn (25cm X 4.6mm ID,5!m )at 25C ,using acetonitriIe -water (416by voIume )system with 1.0mL /min as the mobiIe phase,and detected at 254nm.ReIative standard deviation of 2.5!(n =6)and average recovery of 96!for the method were found.
Key words ：HPLC;Camptotheca acuminata Decne.;Leaves;Camptothecin
测定裸大麦中生育酚和生育三烯酚的
正相高效液相色谱法
夏向东1，吕飞杰1，赵环环2，台建祥1，付
勤1
（1.中国农业科学院作物育种栽培研究所加工室，北京100081；2.中国农业大学作物学院，北京100094）摘要：建立了同时测定裸大麦中!-、"-、#-生育酚和!-、$-、#-生育三烯酚以及$-生育酚+"-生育三烯酚含量的正相高效液相色谱法;采用国产YWG-SiO 2柱（250mm X 4mm ID ，5!m ），V 正己烷
1V
异丙醇
=9911体系
为流动相，流速为1.2mL /min ，荧光检测器检测，激发波长290nm ，发射波长330nm,并采用正交设计法优
化样品的皂化工艺。

关键词：高效液相色谱；裸大麦；生育酚；生育三烯酚；皂化中图分类号：@949.714.2
文献标识码：A
文章编号：1004-4957(2002)02-0018-04
维生素E （VE ）是生育酚（tocopheroI,简写T ）和生育三烯酚（tocotrienoI ，简写T 3）以及具有D -!-生育酚生理活性的衍生物（如酯类等）的总称。

目前已经从植物资源中分离出4种生育酚（!、"
、$、#）和4种生育三烯酚（!、"
、$、#）[1]。

由于生育酚研究较早，生理功能也得到认可，并且已经广泛应用，因此通常所说的维生素E 就是指生育酚，国家标准中规定的维生素E 含量也以!-生育酚为标
准[2]。

随着科学研究的逐步深入，已经证明维生素E 的上述8种同系物的生理功能及活性是有区别的，尤其近10年来已经有越来越多的证据表明生育三烯酚在抗氧化性能、降低胆固醇、抑制癌症等方面具有独特的生理功能，并且在某些方面具有比生育酚更优越的生理功能[3]。

因此，Hendrich 等[4]认为应当把生育三烯酚和生育酚区分开来，并把生育三烯酚、异黄酮、类胡萝卜素作为人体所需的新营养素。

由于生育酚和生育三烯酚结构和性质相近，给分析检测带来难度，目前国内还未见生育三烯酚检测方法的报道，本文报道同时测定生育酚和生育三烯酚的正相高效液相色谱法。

1实验部分
1.1仪器与试剂
美国Waters 高效液相色谱仪：Waters 600色谱泵，Waters 474荧光检测器，MiIIennium 32色谱数据
收稿日期：2001-05-22；修回日期：2002-01-11基金项目：中国农业科学院西部大开发基金资助项目（2000-24）作者简介：夏向东（1974-），男，山东邹平人，博士研究生.
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)
喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析
作者：阎秀峰， 王洋， 于涛， 张玉红， 殷丽君
作者单位：东北林业大学,森林植物生态学开放研究实验室,黑龙江哈尔滨,150040
刊名：
分析测试学报
英文刊名：JOURNAL OF INSTRUMENTAL ANALYSIS
年，卷(期)：2002,21(2)
被引用次数：45次
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