抗过敏实验(鱼胚实验)实验方法

5. 实验材料与试剂
5.1. 材料 5.1.1. 斑马鱼交配盒 5.1.2. 鱼胚收集器 5.1.3. 细胞培养板： 96 孔细胞培养板 5.2. 试剂 5.2.1. 二甲基亚枫 5.2.2. N- 甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醒缩合产生的聚合物(Compoud 48/80) 5.2.3. 氢氧化钠 5.2.4. 三(胫甲基)氨基甲院 5.2.5. N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA) 5.2.6. 二甲基亚枫标准储备液（ 1% ）：量取二甲基亚讽标准品 1.0mL （精确至
oc (BAPNA)储备溶液(1mg/mL)200µL'做为调零对照组。置千恒温培养箱 37
孵育 24h 。 孵育完成后，置千酶标仪 405nm(波长下 ) 测试吸光度。
8. 结果计算
Tryptase 表达水平和抑制率的计算公式如下：
= Tryptase 表达水平(%)
OD 受试样品组、模型组和阳性对照组 -OD调零对照组 " ' ' " ' X 100%
10 、 100 mg/mL 实验浓度，混匀，于 4°c保存备用。
7.2.2. 非水溶性样品：使用二甲基亚讽标准储备液（ 1% ）将受试样品稀释成 0.01 0.1 1 10 、 100 mg/mL 实验浓度，混匀，千 4°c保存备用。
7.3. 对照组溶液 7.3.1. 空白对照组溶液：斑马鱼系统养殖水 7.3.2. 溶剂对照组溶液：二甲基亚讽标准储备液( 1% ) 7.3.3. 模型对照组溶液：斑马鱼系统养殖水、 N- 甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醒缩
肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度
相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶(Tryptase)是肥大
细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到
细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激
活和脱颗粒的标志。斑马鱼鱼胚的肥大细胞，其结构与功能与哺乳类动物相似，
物
5.3.2. 色甘酸钠标准储备溶液(100µg/mL) : 称取标准物质色甘酸10mg(精确至 0.01mg) ，用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至100mL容量瓶，于4°c保存。
6. 实验仪器与设备 6.1. 斑马鱼养殖系统 6.2. 连续变倍体式显微镜(带拍照功能) 6.3. 恒温培养箱 6.4. 天平：精密度 0.00001g 6.5. 全波长酶标仪 6.6. 软件： SPSS 统计分析软件、 Origin 函数绘图软件 7. 实验步骤 7.1. 实验准备 7.1.1. 鱼胚品系：野生型 AB 系斑马鱼自然交配的胚胎； 7.1.2. 鱼胚要求：以斑马鱼开始交配受精为 0 hpf ，选用 72 hpf 健康、无畸形、
调零对照组
Tryptase 抑制率（％）＝
Tryptase模型组- Tryptase 受试样品组和阳性对照组
Tryptase 模型组

X 100%
式中：
OD —酶标仪下测试样品吸光度。
结果保留小数点后三位
9. 质量控制 9.1. 基本原则：测试中设置的对照检测应符合以下情况，如出现非下述标准，
则视为质控不合格。
5.2.10. N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)储备溶液(1mg/mL) 称取N苯 - 甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)10mg(精确至 0.01mg) ，用少量二甲基亚枫溶液溶解并加入三( 胫甲基)氨基甲烧(Tris-H
CL缓冲液) (5.2.9)稀释定容至10mL容量瓶，千4 oc 保存。 5.3. 对照品 5.3.1. 色甘酸钠标准品，纯度乏98%, 或经国家认证并授予标准物质证书的标准
合产生的聚合物(Compoud 48/80)标准储备溶液(10µg/mL) 7.3.4. 阳性对照组溶液：色甘酸钠标准储备溶液(100µg/mL) 、 N- 甲埜-对甲氧基
苯乙胺和甲醒缩合产生的聚合物 (Compoud 48/80) 标准储备溶液 (10µg/m L) 7.4. 实验方法 随机挑选 72 hpf 健康、无畸形、正常发育的鱼胚用千实验。使用 96 孔细 胞培养板为实验载体，每组设置3个平行组，每孔加入鱼胚 10 枚，受试样品 组加入受试样品溶液 100µL'阳性对照组加入色甘酸钠(100µg/mL)实验溶液 100µL'模型对照组和空白对照组加入斑马鱼系统养殖水 100µL'溶剂对照组 加入二甲基亚砚( 1% ) 100µL'置千恒温培养箱 28°C孵育 2h 。 孵育完成后，受试样品组、模型对照组和阳性对照组各加入 N- 甲基-对甲 氧基苯乙胺和甲醒缩合产生的聚合物(Compoud 48/80)标准储备溶液(10µg/mL) 100µL'空白对照组和溶剂对照组各加入斑马鱼系统养殖水 100µL'置千恒温 培养箱 28°C孵育 90min 。 孵育完成后，分别取各实验组上清液 100µL 至新的 96 孔细胞培养板，同 时各实验浓度组加入 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)储备 溶液(1mg/mL)100µL。另每孔加入 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐
参与机体的免疫反应和过敏反应。 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐
(BAPNA) 是类胰蛋白酶 (Tryptase) 特异性底物，可以检测斑马鱼体内的类胰蛋
白酶(Tryptase)表达水平。检测受试样品诱导斑马鱼鱼胚体内 24 小时内的类
胰蛋白酶(Tryptase)表达水平，可以定量分析受试样品的致敏性。
3. 规范性引用文件
下列文件对千本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅
注日期的版本适用千本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所
有的修改单适 ) 用千本文件。
化妆品安全技术规范 2015 版
GB/T 6678 化工产品采样总则
GB/T 6679 固体化工产品采样通则
4. 检测原理
要. 2013.
5.1. 材料................................................. 5 5.2. 试剂................................................. 5 5.3. 对照品............................................... 6 6. 实验仪器与设备 ........................................... 6 7. 实验步骤 ................................................. 6 7.1. 实验准备............................................. 6 7.2. 样品提取............................................. 6 7.3. 对照组溶液........................................... 7 7.4. 实验方法............................................. 7 8. 结果计算 ................................................. 8 9. 质量控制 ................................................. 8 10. 补充文件 ................................................ 8
正常发育的鱼胚用于实验；
7.1.2.1. 胚胎畸形表现形式为：脊柱弯曲，心胞水肿，尾部弯曲，血管堵塞等。 7.1.2.2. 胚胎死亡表现形式：胚胎的凝固，体节形成缺失，尾未分化和心跳缺失
等。
7.1.3. 鱼胚孵育温度： 28土 1°C; 7.2. 样品提取 7.2.1. 水溶性样品：使用斑马鱼系统养殖水将受试样品稀释成 0.01 0.1 1 、、、
5.2.8. 氢氧化钠（ 1mol/L ）溶液配制：称取氢氧化钠 10mg （精确至 0.01mg ), 用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至 250mL容量瓶，千 28oc保存。
5.2.9. 三胫甲基氨基甲炕溶液(Tris溶液)(1mol/L) ：称取三胫甲基氨基甲烧60.5g 加入斑马鱼系统养殖水约950mL溶解，用氢氧化钠溶液（ 5.2.8 ）调节pH 值至12.6 ，并用斑马鱼系统养殖水定容至500mL容量瓶，千28oc保存。
1. 范围
化妆品抗过敏实验（鱼胚实验）实验方法
本标准规定了化妆品致敏性斑马鱼鱼胚实验的实验原理、实验准备、实验
方法、实验结果和实验报告。
本标准适用千液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、可溶性粉剂化妆品原料及
其产品的致敏性检测。
2. 定义
hours post-fertilization(hpf) ：受精后小时数
0.1mL ），用斑马鱼系统养殖水稀释并定容至 100mL 容量瓶，千 28oc保
存。
5.2.7. N- 甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醒缩合产生的聚合物(Compoud 48/80) 标准 储备溶液(10Oµg/mL) : 称取标准物质 N- 甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醒缩合 产生的聚合物(Compoud 48/80) 10mg (精确至 0.01mg) ，用斑马鱼系统养 殖水溶解并定容至 100mL容量瓶，千 4oc 保存。
9.2. 根据观察结果，与空臼对照组相比，模型对照组的 Tryptase 表达水平需更
高，且数据具有统计学意义，说明造模成功有效。
10. 补充文件
参考文献：
[1] 劳乔聪, 俞航萍,徐懿乔等, 斑.马鱼快速检测化学品(药物类 ) 过敏 反应方法的建立及其应用 [C]// 中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘
化妆品 抗过敏实验（鱼胚实验）实验方法
目次
前言 ........................................................ 2 化妆品 抗过敏实验（鱼胚实验）实验方法....................... 4 1. 范围 ..................................................... 4 2. 定义 ..................................................... 4 3. 规范性引用文件 ........................................... 4 4. 检测原理 ................................................. 4 5. 实验材料与试剂 ........................................... 4