生物化学与分子生物学课件：实验四、PAGE

浓缩效应：
• 在pH8.3的Tris- Gly电泳Buffer中，Gly（pI ＝6.0）离解为负离子，通电后,在电场中向 正极泳动。
•甘氨酸进入pH6.7的浓缩胶中，甘氨酸离解减弱，电荷量减少 ，泳速减慢——“慢离子”；浓缩胶Buffer Tris－HCl中Cl－分子 量小，解离不受pH影响，电泳速度快——“快离子”。而血清蛋 白的电泳速度介于甘氨酸和Cl－之间。形成“慢离子—蛋白质离 子—快离子”区域； 快、慢离子电层之间形成一个低电导区，因为电位梯度 V 、电 流强度 I 和电导率 S 之间有如下关系： V=I/S。电位梯度增大， 产生局部高电场强度，吸引慢离子加速向前移动，将位于两电 层之间的蛋白质标本压缩成一个薄层，从而使标本中蛋白质浓 缩。
5、过硫酸铵：100g/L。
6、四甲基乙二胺（TEMED）。
7、10％SDS （十二烷基磺酸钠，阴离子表面活性剂， 可和蛋白质蔬水基团结合）。
8、上样缓冲液：浓缩胶缓冲液6.25ml，蔗糖10g、1g/L溴酚兰
10ml，SDS2.3g（可加入巯基乙醇，强还原剂，可使－S－S
－还原为－SH，蛋白质分子解离成亚基）。
3、浓缩胶缓冲液（pH6.7）： 1mol/LHCl 48ml， Tris 5.98g，蒸馏水80ml，调PH至6.7，加蒸馏水 至100ml。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）： Tris 6g，甘 氨酸28.8g，蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏 水至1000ml；用ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用蒸馏水稀释10倍，并补加 10%SDS至终浓度0.1%。
酸应铵。生成SO4·自由基，触发丙烯酰胺发生聚合反
5、电泳后，正、负极槽内电泳缓冲溶液pH值将发 生改变：负极槽内缓冲溶液pH值上升而正极槽内 缓冲溶液pH值下降，将其混合后，可重复使用 2～3次。
【思考题】
1、在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后， 需在其上加一层水，为什么?
2、电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3、不连续SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含
9、考马斯亮蓝R-250：0.25％，用甲醇：醋酸：蒸馏水
＝5：1：5的溶液配制。
10、脱色液：冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。
11、垂直电泳仪。
12、其它：各种规格移液器及tip、小烧杯、刻度吸管等。
【实验操作】 1、安装垂直电泳仪，务必使胶室密封、洁净。 2、制备分离胶和浓缩胶（按下表加入试剂）
5、电泳：正确连接导线，点样孔置负极侧；恒 流；浓缩：5～10mA，分离：15～20mA；至溴 酚兰抵达距分离胶下缘1cm处，断电、停止电泳。
6、考马斯亮蓝染色：取下胶模，移去盖玻璃板， 做好标记，小心将凝胶板剥下置于染色液中20～ 30min，再用脱色液脱色2～3h，至背景无色。
【实验原理】
分子筛效应
加入试剂（ml） 30%凝胶储备液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 蒸馏水 10%SDS TEMED 10%APS
分离胶 4.9 2.5 — 12.5 0.2 0.05 0.10
浓缩胶 1.1 — 1.25 7.5 0.1 0.05 0.05
灌胶、成胶
分离胶：取一洁净小烧杯，按表配制分离胶液，混 匀，立即加于两玻璃之间至距梳齿下缘约1cm， 在 其 表 面 盖 满 蒸 馏 水 ， 置 于 28℃ 温 度 下 ， 约 20min成胶；此时可看到一清晰的胶水界面。
线性分离范围 （KD） 12－43 16－68 36－94 57－212
【试剂仪器】
1、凝胶储备液：丙稀酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双 丙稀酰胺（Bis）0.8g，蒸馏水至100ml。
2、分离胶缓冲液（pH8.9）： 1mol/LHCl 48ml， 三羟甲基氨基甲烷（Tris）36.6g，蒸馏水80ml， 调PH至8.9，加蒸馏水至100ml。
浓缩胶：以滤纸吸分离胶界面上的水，取一洁净小 烧杯，按表配制浓缩胶液，混匀，加于分离胶 上面至距上缘约0.5cm处，立即轻轻插入梳子， 静止约30min成胶；小心拔出梳子，用蒸馏水洗 涤梳孔。
【实验操作】
3、样品处理：血清0.1ml＋上样缓冲溶液0.9ml，混 匀，沸水浴5min。
4、将凝胶置于电泳缓冲溶液中，点样孔（梳齿孔） 置负极侧，每孔加样6～8ul。
•当标本进入分离胶（pH8.9）后，（分离胶T大，网孔小），甘 氨酸离解增加，所带电荷增加，电泳速度加快，与Cl－电泳速度 基本一致，有效迁移率迅速加大到超过所有样品分子，从而赶 上并超过所有样品分子。低电导区消失，蛋白质组分在同一电 场强度和同一pH值缓冲体系中电泳分离。
电泳Buffer Tris－Gly pH 8.3
①网孔大则泳速快；
② 分子量小、分子呈球形则泳速快；反之则 慢。
1、SDS：阴离子表面活性剂，可和蛋白质疏水基团结合， 使蛋白质分子带上大量负电荷；SDS大于1mmol/L，结合 率为1.4gSDS/g protein，其负电荷大大超过了原有蛋白质 电荷，掩盖了各种蛋白质电荷差异。
2、巯基乙醇：强还原剂，将蛋白质分子中－S－S－还原为 －SH，使蛋白质解离成亚基，分子接近于球形；所以， 样品经过SDS、巯基乙醇处理后，其电泳速率仅仅反映各 蛋白质分子量的差异。
APS:过硫酸铵 (NH4)2S2O8催化 剂 TEMED:四甲基乙二胺 加速剂
PA G
凝胶总浓度T＝（Acr＋Bis）×100％。 交联度C＝Bis/（Acr＋Bis）×100％。 T越大，凝胶孔径越小。 T一定时，C＝5％时凝胶孔径最小。
SDS－PAGE有效分离范围
胶浓度（％）
15 10 7．5 5．0
实验四
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE)分离血清蛋白质
【实验目的】
掌握SDS-PAGE分离血清蛋白质及进行蛋白 质分子量测定原理和基本操作。
【实验原理】
一、成胶反应 CH2=CH－CO－NH2
Acr
＋
CH2=CH－CO－NH—CH2－HN－CO－CH= CH2 Bis
APS TEMED
有TEMED和AP，试述其作用? 4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? 5、比较血清SDS-PAGE和CAM电泳图谱的判别。
Gly
解离强
蛋白质
Cl－
解离完全
浓缩胶Buffer Tris－Hcl pH 6.7
慢离子 离解减弱
蛋白质离子 低电导区
快离子
分离胶Buffer Tris－Hcl pH 8.9
解离强
低电导区消失
【注意事项】
1、所用器皿必须用蒸馏水冲洗。 2、上样量不宜过大，在蛋白质浓度过高时，染料和
蛋白质的氨基所形成的静电键不稳定，其结果不 符合Beer定律，使蛋白定量不准确。 3、Acr和Bis有神经毒性，应注意防护。 4、TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，使过硫