食管癌组织中miRNA-375表达及其甲基化与肿瘤发生发展的关系

食管癌组织中miRNA-375表达及其甲基化与肿瘤发生发展
的关系
ZANG Xuemei;TIAN Hao;WEI Weiwei;SONG Wenqi;LIU Liang;ZHUO Yue;DU Jingfeng
【摘要】目的观察食管癌组织中miRNA-375表达变化,并探讨其表达变化及其甲基化与肿瘤发生发展的关系.方法选择食管癌组织42例(食管癌组)、非癌组织68例(非癌对照组).用实时荧光定量PCR检测两组miRNA-375表达,分析miRNA-375表达变化与食管癌患者临床病理特征的关系,用甲基化特异性PCR检测miRNA-375基因启动子区CpG甲基化阳性率.结果食管癌组miRNA-375相对表达量低于非癌对照组(t=6.692,P＜0.05),食管癌组miRNA-375启动子区甲基化阳性率高于非癌对照组(x2=24.483,P＜0.01).不同性别、年龄、病理类型食管癌组织miRNA-375相对表达量、启动子区甲基化阳性率比较差异无统计学意义(P均＞0.05);低分化、淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌组织中miRNA-375相对表达量低于高中分化、淋巴结无转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌组织(P均＜
0.05),miRNA-375启动子区甲基化阳性率高于高中分化、淋巴结无转移、TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌组织(P均＜0.05).结论 miRNA-375在食管癌组织中呈低表达与其启动子区甲基化有关,且miRNA-375参与食管癌的发生发展.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2019(059)001
【总页数】4页(P9-12)
【关键词】食管癌;微小RNA-375;甲基化
【作者】ZANG Xuemei;TIAN Hao;WEI Weiwei;SONG Wenqi;LIU
Liang;ZHUO Yue;DU Jingfeng
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】R735.1
食管癌是我国也是世界范围内常见恶性肿瘤之一，以手术为主的综合治疗是目前主要治疗方式，但因其发病隐匿、早期症状不明显，多数患者发现时已到中晚期，错过了手术最佳时机，5年生存率低于15%[1]，寻找更有价值的生物标记物与治疗
靶点成为各国学者共同关注的焦点。

微小RNA(miRNA)是一类存在于各种真核生
物中的小分子非编码RNA，主要调节内源性基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分
化等过程[2]。

DNA甲基化调控是表观遗传学的主要方式，基因启动子区CpG岛
的DNA甲基化可决定特定miRNA的表达与沉默[3]。

相关研究表明，miRNA-35作为抑癌基因在大肠癌、原发性肝癌中呈异常低表达状态[4，5]，但目前还少有miRNA-375在食管癌表达及甲基化调控的研究。

本研究观察食管癌组织中miRNA-375表达变化，并探讨其表达发生变化的机制及临床意义。

1 资料与方法
1.1 临床资料收集2016年3月～2017年3月佳木斯大学附属第一医院经胃镜采集的110例新鲜组织标本，根据活检结果分为食管癌组42例、非癌对照组68例。

食管癌患者男30例、女12例；年龄50～72(61.54±7.12)岁；肿瘤高、中分化
14例，低分化28例；淋巴结转移19例；TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ
期27例；病理类型为髓质型20例，溃疡型13例，覃伞型9例。

非癌对照组患
者男48例、女20例；年龄55～74(61.32±7.24)岁。

两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

标本采集后迅速置于液氮中冷冻，保存于-80 ℃冰箱。

本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属均知情同意。

1.2 两组miRNA-375表达检测采用实时荧光定量PCR。

使用Invitrogen公司TRIzol试剂裂解提取食管癌组织与正常食管组织RNA，采用紫外分光光度计滴定RNA浓度，控制RNA吸光度(OD)260/OD280为1.9～
2.1，用无酶水稀释RNA 至500～1 500 ng/μL。

用miRcte miRNA Cdna第一链合成试剂逆转录合成cDNA。

采用ABI 7900HT荧光定量PCR仪，荧光染料购自凯基生物SYBR GreenⅠ，试剂盒购自miRcute miRNA。

反应体系12.5 μL，扩增条件：热启动(95 ℃ 5 min)、变性(95 ℃ 10 s)、退火(56 ℃ 10 s)、延伸(72 ℃ 10 s)，共40个循环。

以U6为内参。

用2-△△Ct法计算miRNA-375相对表达量。

1.3 miRNA-375启动子区甲基化检测采用甲基化特异性PCR。

CpG岛预测：采
用美国加州大学对克鲁兹分校基因数据库提取miRNA-375序列，通过预测相应
基因调控区域，显示miRNA-375启动因子存在CpG岛(表达可能受DNA甲基化调控)。

采用欧洲生物信息学研究所CpG plot软件预测上述基因调控区域序列，
验证CpG岛的存在。

用天根生化公司DNA/RNA提取试剂盒提取DNA，检测含
量与纯度后，采用亚硫酸氢钠修饰DNA样本，使用DNA纯化试剂盒进行脱硫处理。

采用引物设计程序“MethPrimer”设计合成miRNA-375甲基化、非甲基化特异引物序列，由南京金斯瑞生物科技公司合成。

甲基化miRNA-375上游序列：5′-GATTTATAATATTTTGGGGAGGC-3′，下游序列：5′-ATAAACGTAAAAACGAAACTTCGAA-3′；非甲基化miRNA-375上游序列：5′-ATTTAGAATATTTTGGTGGAGGTGA-3′，下游序列：5′-ATAAACATAAAAACAAAACTTCAAA-3′。

甲基化阳性判断：甲基化特异性引物
扩增出目的条带，非甲基化特异性引物有或无条带扩增出；非甲化：非甲基化特异
性引物扩增出目的条带，甲基化引物未扩增出条带。

1.4 统计学方法采用SPSS21.0统计软件。

计量资料用表示，比较采用单因素方差分析或配对t检验；计数资料比较采用χ2检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 两组miRNA-37表达比较食管癌组miRNA-375相对表达量为0.028±0.008、非癌对照组为0.042±0.012。

食管癌组miRNA-375相对表达量低于非癌对照组(t=6.692，P<0.05)。

2.2 两组miRNA-375启动子区甲基化阳性率比较食管癌组miRNA-375启动子
区甲基化阳性阳性率为71.43%(30/42)，非癌对照组为23.53%(16/68)。

食管癌
组miRNA-375启动子区甲基化阳性率高于非癌对照组(χ2=24.483，P<0.01)。

2.3 miRNA-375表达与食管癌患者临床病理特征的关系不同性别、年龄、病理类型食管癌组织miRNA-375相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)；低分化、淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌组织miRNA-375相对表达量低于高中分化、淋巴结无转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌组织(P均<0.05)。

见表1。

表1 miRNA-375表达与食管癌患者临床病理特征的关系临床病理特征nmiRNA-375tP性别 0.7650.176 男300.029±0.013 女120.026±0.010年龄
(岁)0.7210.201 >60260.027±0.011 ≤60160.030±0.016组织学类型
3.4290.025 高、中分化140.036±0.012 低分化280.024±0.010淋巴结转移
5.2230.014 有190.017±0.008 无230.037±0.015TNM分期4.9210.016 Ⅰ～Ⅱ期150.040±0.014 Ⅲ～Ⅳ期270.021±0.010病理类型髓质型200.028±0.012
溃疡型130.027±0.0140.6160.312 覃伞型90.030±0.015
2.4 miRNA-375启动子区甲基化与食管癌患者临床病理特征的关系不同性别、
年龄、病理类型食管癌组织miRNA-375启动子区甲基化阳性率比较差异无统计
学意义(P均>0.05)；低分化组织学类型、淋巴结有转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管
癌组织miRNA-375启动子区甲基化阳性率高于高中分化、淋巴结无转移、TNM
分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌组织(P均<0.05)。

见表2。

表2 miRNA-375启动子区甲基化阳性与食管癌临床病理特征的关系[例(%)]临床
病理特征nmiRNA-375启动子区甲基化阳性χ2P性别0.1050.812 男
3021(70.00) 女129(75.00)年龄(岁)0.0910.098 >602619(73.08)
≤601611(68.75)组织学类型4.7250.018 高、中分化147(50.00) 低分化
2823(82.14)淋巴结转移5.5360.013 有1917(89.47) 无2313(56.52)TNM分期11.2930.000 Ⅰ～Ⅱ期156(40.00) Ⅲ～Ⅳ期2724(88.89)病理类型髓质型
2015(75.00) 溃疡型139(69.23)1.0120.085 覃伞型96(66.67)
3 讨论
我国是食管癌高发地区，每年食管癌死亡人数高达20万，约占所有恶性肿瘤死亡人数的16.05%[6]。

食管癌发病原因尚不清楚，随着分子生物学研究的不断深入，越来越多学者认为食管癌的发生是一个多因素、多基因、多阶段共同作用的结果，是致癌基因、抑癌基因结构与功能发生异常不断累积与协同作用的过程[7]。

miRNA、DNA甲基化作为重要表观遗传学调控机制，不仅调节机体正常生长发育，也直接参与了肿瘤发生、发展过程[8]。

miRNA是一类小分子单链RNA，长度约为18～25个核苷酸，可调节内源性基因表达，参与肿瘤的生成与发展。

有研究表明，不同miRNA异常表达或抑制肿瘤细胞增殖、或诱导致癌基因生长。

如miRNA-222异常高表达可诱导侵袭性甲状腺
乳头状癌的侵袭与转移[9]。

miRNA-375位于人染色体上2q35区上cryba2和Cadc108的基因区域间的片段，是一种胰岛特异性miRNA，现已发现在不同肿瘤发病过程，其表达升高或降低各不相同[10]。

如在胃癌组织中明显降低，而在前列腺癌组织中表达明显升高[11]。

对食管癌组织中miRNA-375表达变化的研究较少。

本研究食管癌组织中miRNA-375表达低于非癌对照组，且低分化、淋巴结转移、
TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌组织miRNA-375相对表达量更低，与陆翰杰等[12，13]文献报道基本相似。

miRNA表达异常的机制尚末完全阐明，可能与转录因子、表观遗传修饰等因素有关。

DNA甲基化作为表观遗传修饰的一种方式，影响着细胞发育与基因表达。

DNA甲基化发生于启动子区CpG岛，通过甲基化、去甲基化调节基因的表达或沉默。

相关研究表明，人类许多肿瘤中均存在不同程度的DNA异常甲基化现象，启动子区CpG岛出现异常超甲基化可诱导基因转录沉默，降低抑癌基因、凋亡基因表达水平，参与肿瘤发生发展。

而且启动区CpG岛超甲基化存在于恶性肿瘤癌前病变阶段，通过检测基因甲基化状态，可作为诊断肿瘤的敏感指标。

本研究中，食管癌组织miRNA-375启动子区甲基化阳性率高于非癌对照组，同样与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关。

综上所述，食管癌组织中miRNA-375呈低表达，miRNA-375甲基化可能是导致miRNA-375低表达的主要原因；miRNA-375低表达与组织分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期明显相关。

临床可将miRNA-375甲基化水平、miRNA-375表达作为食管癌早期诊断及预后判断的依据。

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