杭州湾海域产纤维素酶海洋真菌的分离筛选及鉴定

杭州湾海域产纤维素酶海洋真菌的分离筛选及鉴定
曲均革;金甚益;绕静
【摘要】[目的]筛选产纤维素酶的海洋真菌资源.[方法]从杭州湾海域采集海水和海泥(沙)等样品,采用海水PDA培养基进行富集培养,然后在羧甲基纤维素钠培养基上进行真菌分离纯化,采用刚果红染色法筛选产酶菌株,并对其中纤维素酶活性较高的菌株进行了26S rDNA ITS扩增及序列测定.[结果]共筛选到72株产纤维素酶的海洋真菌,两株高产菌株的同源序列比对结果分别与Penicillium funiculosum和Pseudocercosporella fraxini的同源性高达100％和99％.[结论]该研究为纤维素酶高产菌株的改造和定向进化奠定了资源基础%[Objective] The aim was to isolate and identify the cellulate producing marine fungi. [ Method j Thr seawater and sea mud (sand) were collected from Hangzhou Bay, PDA seawaler medium was applied for enriched culture. The medium containing CMC-Na was ap-plied for isolation and purification of marine fungi. And then the cellulose producing strains were screened by the CMC/Congo Red method. The strains with high cellulase activity were amplified by 26S rDNA ITS and then determined by sequencing, [ Result] A total of 72 strains of marine fungi which could produce cellulase were screened from Hangzhou Hay. The two high yield cellulose producing strains had 100% and 99% homology with Penicilliuni funwulosum and Pseudocercosporella fraxini, respectively. [ Conclusion ] The research laid a good foundation for the selection and directed evolution of highly cellulase-producing strains.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)016
【总页数】3页(P8816-8817,8822)
【关键词】纤维素酶;海洋真菌;分离;筛选;鉴定
【作者】曲均革;金甚益;绕静
【作者单位】浙江医药高等专科学校生物与食品系,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校生物与食品系,浙江宁波315100;浙江医药高等专科学校生物与食品系,浙江宁波315100
【正文语种】中文
【中图分类】S188;Q938
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，我国是一个农业大国，作物秸秆(如稻草、麦秆等)的年产量非常巨大，目前绝大多数只是作为燃料燃烧，造成了资源的极大浪费［1］。

纤维素酶能降解纤维素生成葡萄糖，在能源转化、食品加工、医药生产、石油开采、废水处理等众多领域中有十分广泛的应用，开发前景广阔［2－4］。

微生物是纤维素酶最主要的生物来源，其中产酶活性较高的菌株主要来源于真菌中的木霉、曲霉、青霉等，尤以木霉属突出，如里氏木霉、康氏木霉、绿色木霉等是目前公认的较好的纤维素酶生产菌［5－7］。

但目前获得的生产纤维素酶的菌株普遍存在着产酶成本高、酶活性不稳定等问题，因此重视纤维素酶产生菌的分离和筛选工作，丰富纤维素酶产生菌的资源和基因库具有重要意义，可为后续的诱变育种和基因工程改造以及酶的深入研究奠定基础。

该试验从杭州湾海域采集样
品，进行产纤维素酶海洋真菌的分离纯化，并对筛选到的高产酶菌株采用分子生物学方法进行了菌株鉴定，以期为产纤维素酶海洋真菌的改造和深入研究奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品。

试验材料为从浙江杭州湾海域采集的海水和海泥(沙)样品。

1.1.2 培养基。

海洋真菌富集培养采用海水PDA培养基:1 000 ml海水中加入200 g去皮切块的马铃薯，煮沸30 min，然后用4～6层纱布过滤。

滤液中加入20 g
蔗糖，18 g琼脂，蒸馏水定容1 000 ml。

灭菌后温度降至50℃左右加入50 mg
青霉素和50 mg链霉素以抑制海洋细菌的生长和繁殖。

海洋真菌分离纯化和筛选采用羧甲基纤维素钠培养基，配方为:羧甲基纤维素钠10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨 1 g/L，琼脂18 g/L，陈海水定容。

1.2 方法
1.2.1 海洋真菌富集培养。

将5 ml海水样品加入到用250 ml三角瓶分装的50 ml 海洋真菌富集培养基中，于28℃、150 r/min培养7 d。

取10 g海泥(沙)，加入
到有玻璃珠的90 ml无菌海水中充分震荡30 min，然后取5 ml加入到50 ml海
洋真菌富集培养基中，28℃、150 r/min培养7 d。

1.2.2 海洋真菌分离纯化。

富集培养7 d后，将富集培养液进行连续梯度稀释，稀释成 100、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5浓度。

将各稀释度分别取
200 μl涂布在羧甲基纤维素钠培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中培养，挑取平板上单个菌落接种到沙保斜面上。

1.2.3 纤维素酶活性菌株的筛选。

在羧甲基纤维素钠琼脂培养板上接种分离纯化的海洋真菌，于28℃恒温培养箱中培养5 d，量取菌落直径大小。

然后将菌落从培
养基上刮下，用0.1%的刚果红溶液染色30 min，再用1 mol/L NaCl洗脱液进行
洗脱，洗脱2次，每次浸泡20 min。

对光观察是否产生透明水解圈，产生透明水解圈者是产纤维素酶菌株。

量取透明水解圈的大小，以透明圈直径与菌落直径的比值(Hc)表示酶活大小，Hc值越大，表明酶活越强。

1.2.4 菌种鉴定。

26S rDNA ITS扩增及序列测定:使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.D317)进行PCR扩增目的片段。

产物经琼脂糖
凝胶电泳后，使用TaKa-Ra Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段，以Seq Forward为引物进行DNA测序。

根据测序结果，在NCBI上与GenBank里已知核酸序列进行BLASTN比对分析，把与该序列同源性较高的已知菌株序列，用Clustalx 1.83软件进行多序列比对，
采用Neighbour－Joining方法，通过MEGA 5.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析
2.1 产纤维素酶活性菌株的筛选结果采用刚果红染色法，从浙江杭州湾海域采集
的样品中，经过多次分离纯化和活性验证，筛选到69株具有纤维素酶活性的海洋真菌菌株(图1)。

其中Hc值大于2的有2株，占总活性菌比例的2.86%;Hc值介
于1.5和2之间的有17株，占总活性菌比例的24.29%;Hc值小于1.5的有51株，占总活性菌比例的72.86%(表1)。

图1 MF125菌株在筛选平板上形成的透明圈
表1 刚果红染色筛选的部分活性菌结果菌株编号菌落直径D1∥cm 透明圈直径
D2∥cm Hc(D2/D1)MF008 0.50 0.90 1.80 MF019 1.40 2.20 1.57 MF045 2.40 4.20 1.75 MF048 2.20 3.30 1.50 MF062 2.10 3.50 1.67 MF072 2.50 4.40 1.76 MF074 2.30 4.30 1.87 MF079 1.60 2.70 1.69 MF091 1.80 2.70 1.50 MF094
1.60
2.40 1.50 MF100 1.40 2.20 1.57 MF101 1.00 1.50 1.50 MF103 1.50
3.00
2.00 MF105 1.80
3.00 1.67 MF109 1.80 2.70 1.50 MF111 0.80 1.50 1.88
MF117 1.00 1.60 1.60 MF118 1.20 2.10 1.75 MF125 0.45 1.20 2.67
2.2 强活性菌株的系统发育分析结果根据纤维素酶活性菌株的筛选结果，选择活性相对较高的MF103和MF125菌株进行26S rDNA ITS序列的PCR扩增和测序分析，获得26S rDNA基因序列。

将其与GenBank数据库进行BLASTN比对分析，与所筛选到的活性菌株26S rDNA基因序列同源性最高的菌株及其注册号如表2所示。

表2 产纤维素酶活性菌株的分子鉴定菌株编号相似性最高菌株相似度∥%MF103 Penicillium funiculosum(HQ115695.1)100 MF125 Pseudocercosporella fraxini(GU214682.1)99
对活性菌株的26S rDNA序列采用Clustalx 1.83软件进行序列比对，然后利用MEGA 5.0软件的邻接法(Neighbor－Joining，NJ)构建了2株具有纤维素酶活性的海洋真菌及其同源性较高菌株的系统发育树，结果如图2和图3所示。

图2 菌株MF103的系统发育树
3 讨论
纤维素是年产量巨大的可再生资源，成功开发利用该资源对人类的可持续发展具有非常重要的意义。

目前获得的生产纤维素酶的菌株普遍存在着产酶成本高、酶活性不稳定等问题，因此寻找更高效、具有市场竞争力的菌种资源是当务之急。

今后对该领域的研究主要集中在以下2个方面:一是从一些特殊和极端环境中(如海洋、极地、盐湖、温泉、火山口附近等)筛选纤维素酶活性菌株，这些特殊生境中的菌一般都具有独特的酶学性质，比如耐高温、耐寒、耐高盐、耐强酸强碱等特性，可扩大纤维素酶的应用范围［8］。

二是应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌，在工程菌中实现纤维素酶基因的表达，并通过定向进化改进酶催化剂的稳定性及反应活性，提高纤维素酶的产量和质量［9－11］。

通过文献调研和科技查新可知，目前浙江海域产纤维素酶的海洋真菌资源尚未得到有效的开发。

该研究结合浙江的地域特色和资源优势，从杭州湾海域采集海洋样品，筛选到72株产纤维素
酶的海洋真菌，并对其中活性较高的2种菌进行了菌种鉴定和系统发育分析，该
结果为产纤维素酶海洋真菌后续的深入研究奠定了资源基础。

图3 菌株MF125的系统发育树
参考文献
［1］罗晶，解玉红，李思蓓，等.秸秆资源的开发及利用研究［J］.安徽农业科学，2011，39(11):6415－6418.
［2］刘晓晶，李田，翟增强.纤维素酶的研究现状及应用前景［J］.安徽农业科学，2011，39(4):1920－1921，1924.
［3］窦烨，王清路，李俏俏.纤维素酶的应用现状［J］.中国酿造，2008(12):15
－17.
［4］吴大付，任秀娟，李东方，等.纤维素酶的应用现状与前景［J］.广西轻工业，2007(12):1－2.
［5］MADHU K M，BEENA P S，CHANDRASEKARAN M.Extracellular β-glucosidase Production by a Marine Aspergillus sydowii BTMFS 55 under Solid State Fermentation Using Statistical Experimental Design
［J］.Biotechnol Bioprocess Eng，2009，14(4):457－466.
［6］JORGENSEN H，MORKEBERG A，KROGH K B R，et al.Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species:effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis［J］.Enz Microb Technol，2005，36(1):42－48.
［7］ZHANG C，LI D，YU H S，et al.Purification and characterization of piceidβ-D-glucosidase from Aspergillus oryzae［J］.Proc Biochem，2007，42(1):83－88.
［8］ZHANG Y H P，HIMMEL M E，MIELENZ J R.Outlook for cellulase
improvement:screening and selection strategies［J］.Biotechnol Adv，2006，24:452－481.
［9］MEILLEUR C，HUPE J F，JUTEAU P，et al.Isolation and characterization of a new alkali-thermostable lipase cloned from a metagenomic library［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36:853－861. ［10］CANTWELL B A，MCCONNELL D J.Molecular cloning and expression of a Bacillus subtilis β-glucanase gene in Escherichia coli［J］.Gene，1983，23(2):211－219.
［11］刘萌，战利，马红霞，等.纤维素酶及纤维素酶基因工程学研究进展［J］.
安徽农业科学，2011，39(16):9515－9517.。