高效富集肺癌及癌旁组织转录因子的技术-cattfre

高效富集肺癌及癌旁组织转录因子的技术￣ｃａｔＴＦＲＥ
谢辉１㊀陈振岗１㊀史学军１㊀邓增华２㊀孙长青１㊀王辉１㊀李一鸣１㊀秦钧３㊀王广舜１㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀肺癌是中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤ꎬ治疗及预后并没有取得太大的进展ꎮ研究发现转录因子(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬＴＦ)与肺癌的发生发展甚至预后关系密切ꎮ但在组织水平上大规模鉴定ＴＦ存在难度ꎬ本文首次利用ｃａｔＴＦＲＥ技术对肺癌及癌旁组织的ＴＦ进行富集ꎬ并初步探讨这些变化调控的生物过程ꎮ方法㊀取肺癌及癌旁组织样本ꎬ分别提取其的核蛋白ꎬ利用ＴＦ富集技术ｃａｔＴＦＲＥꎬ对癌及癌旁组织的ＴＦ进行富集ꎬ同时运用蛋白质组学手段ꎬ对表达差异的ＴＦ进行动态描绘和定量分析ꎮ对于鉴定到的发生变化的ＴＦ及蛋白ꎬ通过蛋白质组学方法ｉＢＡＱ㊁ＫＥＧＧ信号通路等进行生物信息学分析ꎮ结果㊀癌症组平均鉴定到１４３１种蛋白ꎬ平均２２３种ＴＦꎻ癌旁组中平均鉴定到１３８３种蛋白ꎬ平均１９１种ＴＦꎮ癌症组与癌旁组相比ꎬ表达上调的蛋白和ＴＦ分别有３７８种和有１０８种ꎬ表达下调的蛋白和ＴＦ分别有２４５种和５０种ꎮ对差异表达的ＴＦ及蛋白分析发现ꎬ如转录因子ＮＦＡＴｃ１㊁ＦＯＸＡ１等ꎬＶＥＧＦ信号通路㊁Ｎｏｔｃｈ信号通路等都与肺癌的发生发展相关ꎮ结论㊀ｃａｔＴＦＲＥ可高效富集肺癌及癌旁组织的ＴＦꎬ为接下来大样本㊁高数量鉴定肺癌组织的ＴＦ提供了技术支持ꎬ为未来对大规模肺癌的深入研究提供一些重要的依据和基础ꎮ
㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀转录因子ꎻ富集ꎻ肺癌ꎻ癌旁
ＨｉｇｈｌｙｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓｂａｓｅｄｏｎｃａｔＴＦＲＥＴｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙ
ＸＩＥＨｕｉ１ꎬＣＨＥＮＺｈｅｎ￣ｇａｎｇ１ꎬＳＨＩＸｕｅ￣ｊｕｎ１ꎬＤＥＮＧＺｅｎｇ￣ｈｕａ２ꎬＳＵＮＣｈａｎｇ￣ｑｉｎｇ１ꎬＷＡＮＧＨｕｉ１ꎬＬＩＹｉ￣ｍｉｎｇ１ꎬＱＩＮＪｕｎ３ꎬＷＡＮＧＧｕａｎｇ￣ｓｈｕｎ１
１.ＴｉａｎｊｉｎＢａｏｄｉＨｏｓｐｉｔａｌꎬＢａｏｄｉＣｌｉｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＴｉａｎｊｉｎ㊀３０１８００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＢｅｉｊｉｎｇＳｈｉｊｉｔａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮｉｎｔｈＳｃｈｏｏｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＢｅｉｊｉｎｇ㊀１０００３８ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＢｅｉｊｉｎｇＰｒｏ￣ｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒꎬＢｅｉｊｉｎｇ㊀１０２２０６ꎬＣｈｉｎａ
㊀㊀ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＬｕｎｇｃａｎｃｅｒｈａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＣｈｉｎａ.Ｔｈｅｒｅｈａｓｂｅｅｎｌｉｔｔｌｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ.Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ＴＦ)ｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｖｅｎｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＴＦｓｏｎａｌａｒｇｅｓｃａｌｅａｔｔｈｅｔｉｓｓｕｅｌｅｖｅｌ.ＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｃａｔＴＦＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｎｒｉｃｈＴＦｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓ￣ｓｕｅｓｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅꎬａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｔｈｅｓｅｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｅｘｐｌｏｒｅｄ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｎｕｃｌｅｏ￣ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴＦｓｗａｓｅｎｒｉｃｈｅｄｂｙＴＦｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙ￣ｃａｔＴＦＲＥ.ＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＦｓｗｅｒｅｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙｄｅｐｉｃｔｅｄａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙａｎａ￣ｌｙｚｅｄｂｙｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ.ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｌｔｅｒｅｄＴＦｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｂｙｉＢＡＱａｎｄＫＥＧＧｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ￣ｗａｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆＴＦｓｗａｓ１４３１ｉｎｔｈｅｃａｎｃｅｒｇｒｏｕｐａｎｄ１３８３ｉｎｔｈｅｐａｒａ￣ｃａｎｃｅｒｇｒｏｕｐꎬｗｉｔｈａｎａｖｅｒａｇｅｏｆ１９１ＴＦｓ.Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ３７８ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ１０８ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄＴＦｓｉｎｔｈｅｃａｎｃｅｒｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｄｊａｃｅｎｔｃａｎｃｅｒｇｒｏｕｐꎬａｎｄ２４５ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ５０ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄＴＦｓｉｎｔｈｅｃａｎｃｅｒｇｒｏｕｐ.ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＴＦｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓＮＦＡＴｃ１ꎬＦＯＸＡ１ꎬａｎｄｓｏｏｎꎬａｓｗｅｌｌａｓＶＥＧＦｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ｃａｔＴＦＲＥｃａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｅｎｒｉｃｈＴＦｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓ.Ｉｔｐｒｏｖｉｄｅｓｔｅｃｈ￣ｎｉｃａｌｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＴＦｉｎｌａｒｇｅｓａｍｐｌｅｓａｎｄｌａｒｇｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓꎬａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｓｓｏｍｅｉｍｐｏｒ￣ｔａｎｔｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ.
㊀㊀ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔꎻｌｕｎｇｃａｎｃｅｒꎻｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ
ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００９－６６６３.２０２０.０１.０２６
作者单位:１.３０１８００㊀天津ꎬ天津市宝坻区人民医院ꎬ天津医科大学宝坻临床学院
２.１０００３８㊀北京ꎬ北京大学第九临床学院北京世纪坛医院
３.１０２２０６㊀北京ꎬ北京蛋白质组学研究中心
通信作者:王广舜ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｗｇｓ＠ｂｄｄｈｏｓｐｉｔａｌ.ｃｏｍ
㊀㊀肺癌作为一种发病率和死亡高居世界第二ꎬ在中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤ꎬ已经严重影响到人类的生命健康[１－２]ꎮ中国国家癌症中心数据显示ꎬ２０１４年全国恶性肿瘤估计新发病例３８０ ４万ꎬ死亡病例２２９ ６万例ꎬ其中肺癌每年发病约７８ １万ꎬ死亡病例６２ ６万例ꎬ均位居全国首位[３]ꎮ２０００－２０１４年全球癌症生存率变化趋势监测研究报告(ＣＯＮＣＯＲＤ￣３)显示ꎬ中国肺癌的发病占所有癌症的２２ ６％ꎬ而５年生存率仅１９ ８％[４]ꎮ虽然针对肺癌的研究一直在持续进行ꎬ但进展很难令人满意ꎮ继靶向治疗后ꎬ随着ＣＡＲ￣Ｔ[５－６]细胞治疗及ＰＤ１/ＰＤ￣Ｌ１抑制剂[７－８]的横空出世ꎬ免疫治疗极大的改变了癌症科研和治疗的理念ꎬ为肺癌的治疗带来了新的革命性进展ꎬ但免疫治疗尚处于高速发展阶段ꎬ很多技术环节仍有待细化与改进ꎬ有效率较低(约２０％)㊁优势人群还不很明确㊁免疫相关不良事件(ｉｍｍｕｎｅ￣ｒｅｌａｔｅｄａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔｓꎬｉｒＡＥ)等[９－１０]问题仍需要进一步全面认识ꎮ近期由吴一龙教授牵头的全国多中心随机对照Ⅱ期临床研究[１１]:新辅助靶向治疗对比化疗的头对头研究(ＣＴＯＮＧ１１０３)结果发表在ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ杂志上ꎬ研究显示术前应用靶向药物(厄洛替尼)ꎬ有效率高于化疗约２０％ꎬ手术成功率提高约１５％ꎬ并且降低了术后复发风险ꎬ中位无进展生存期(ｍｅｄｉａｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ￣ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌꎬｍＰＦＳ)提高了１０个月ꎬ首次证实了ＥＧＦＲ￣ＴＫＩ在新辅助及辅助阶段的应用ꎬ但总体而言ꎬ如客观缓解率(ｏｂ￣ｊｅｃｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｒａｔｅꎬＯＲＲ)等获益并未达到预期ꎮ新的方向的研究仍迫在眉睫ꎮ
转录因子(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬＴＦ)作为与ＤＮＡ特异性结合并调控转录功能的蛋白质家族ꎬ几乎所有的生物过程ꎬ都是由转录调节系统调控的[１２]ꎮ多种疾病的发生就是源于一个调控体系的失调ꎬ研究发现[１３]１６４个ＴＦ直接与２７７种疾病或症状相关联ꎮ许多ＴＦ在肿瘤的发生㊁发展的过程中就起到关键作用ꎬ如转录因子ＥＧＦＲꎬＫＲＡＳꎬＨＥＲ２等ꎮ所以ꎬ基于目前肺癌的高发病率㊁高死亡率及ＴＦ在肿瘤发生发展过程中所起关键作用ꎬ在转录水平上研究肺癌组织与癌旁组织中ＴＦ的差异表达ꎬ可能对肺癌发病机制㊁早期诊断㊁转移及治疗有重要的指导意义ꎮ
鉴于ＴＦ作为核提取物(ｎｕｃｌｅａｒｅｘｔｒａｃｔꎬＮＥ)ꎬ其低丰度性[１４]ꎬ将其从高丰度的蛋白质中大规模鉴定出来一直是个难题ꎮ我们研发了基于蛋白质组学技术的可以有效富集低丰度ＴＦ的检测技术 ｃａｔＴＦＲＥ(ａｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄｔａｎｄｅｍａｒｒａｙｏｆｔｈｅｃｏｎｓｅｎ￣ｓｕｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓꎬＴＦ富集技术)[１４]ꎬ可以从细胞中大规模鉴定内源性ＴＦꎮ但其在肺癌组织水平上对ＴＦ的富集效率如何还不得而知ꎬ本文首次利用ｃａｔＴＦＲＥ技术对肺癌及癌旁组织的ＴＦ进行富集ꎬ并初步探讨其调控的生物过程ꎮ
资料与方法
㊀㊀一㊁标本和取材
来自天津医科大学宝坻临床学院肿瘤科病理证实的肺癌组织及癌旁组织６例ꎮ受试者均被告知组织标本用于研究目的ꎬ知情同意ꎮ
二㊁生物素标记的ＤＮＡ(Ｂｉｏｔｉｎ￣ＤＮＡ)的获得１㊀ＤＮＡ反应元件的设计
根据已知高等脊椎动物的转录因子结合谱(ｈｔ￣ｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/ꎬＴｈｅｈｉｇｈ￣ｑｕａｌｉｔｙｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｆｉｌｅｄａｔａｂａｓｅ)ꎬ人工合成串联的结合序列ꎬ并将其构入载体ｐＧＥＸ４Ｔ２中ꎮ
２㊀体外扩增ＤＮＡ序列
通过人工合成生物素(ｂｉｏｔｉｎ)标记的聚合酶链式反应(ＰＣＲ)引物ꎬ以构建好的ｐＧＥＸ４Ｔ２￣ｃａｔＴＦＲＥ为模板ꎬ经ＰＣＲ来扩增目的产物片段ꎮ
３㊀琼脂糖凝胶电泳及ＤＮＡ回收
按照ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ(快速琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒)的说明书进行ꎬ得到Ｂｉｏｔｉｎ￣ＤＮＡꎮ三㊁组织样本核蛋白的制备
肺癌组织及癌旁组织核提取物(ＮＥ)的提取按照从ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司购买的 ＮＥ￣ＰＥＲ®Ｎｕ￣ｃｌｅａｒａｎｄＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ 试剂盒上的说明书进行提取ꎮ提取完成之后用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[１５]测定核蛋白的浓度ꎮ
四㊁转录因子的富集
使用ｃａｔＴＦＲＥ方法对组织样本的ＴＦ进行富集ꎮ每组样品用３ｐｍｏｌ(６μｇ)Ｂｉｏｔｉｎ￣ＤＮＡ与１２０μＬＤｙ￣ｎａｌＭ２８０链霉亲和素磁珠结合后ꎬ再与６００μｇ的组织核提取物结合ꎬ得到的ｐｒｏｔｅｉｎ￣ＤＮＡ复合物ꎬ然后洗去磁珠上非特异结合的蛋白ꎬ经过１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)对富集的样品进行预分离ꎬ进行胶内酶解㊁肽段萃取ꎬ并将每组样品合并为３个组份ꎬ经６０ħ真空抽干ꎬ进行质谱分析及鉴定ꎮ五㊁生物信息学分析
应用基于强度的绝对定量方法(ｉＢＡＱ)ꎬ依据组
间ｉＢＡＱ值之间的比值对蛋白的表达量变化进行评定[１６]ꎮ对于鉴定到的发生变化的ＴＦ及蛋白ꎬ通过ＫＥＧＧ＿ＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓ进行生物信息学分析ꎮ当
Ｓｔｕｄｅｎｔｔ￣检验Ｐ<０ ０５时ꎬ认为差异有统计学意义ꎮ
结㊀㊀果
一㊁ｃａｔＴＦＲＥ可高效富集肺癌及癌旁组织的转录因子
研究报道[１３]ＴＦ的表达数量在组织类型之间变化很大ꎬ范围从阑尾㊁皮肤约１５０种ꎬ到全脑㊁甲状腺超过３００种ꎬ其中肺的ＴＦ约２７０种ꎮ然而ꎬ所有表达基因相关的ＴＦ在所有样本表达基因中的比例稳定在６％左右[１３ꎬ１７]ꎮ由于富集的ＴＦ复合体以及相关蛋白的复杂程度较高ꎬ为提高ＴＦ的鉴定水平ꎬ我们通过传统的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥꎬ在蛋白水平对富集样品进行预分离ꎬ经胶内酶解和肽段萃取后为分３个组分进行质谱鉴定ꎮ质谱鉴定结果如下:肺癌组的质谱扫描谱图的平均利用率>５０％ꎬ通过数据库搜索ꎬ得到高可信度肽段数７３６９~１０４２３ꎬ平均高可信度肽段数９９１６ꎻ鉴定到蛋白数为１２５６~１６８９ꎬ平均蛋白数１４３１种(特异性肽段数量ȡ１)ꎬ含有转录因子１９３~２６４种ꎬ平均２２３种ꎻ癌旁组中ꎬ得到高可信度肽段数６９８４~９８４３ꎬ平均高可信度肽段数８７５６ꎻ鉴定到蛋白数为１２３６~１５９０ꎬ平均蛋白数１３８３种(特异性肽段数量ȡ１)ꎬ含有转录因子１８２~２０７种ꎬ平均１９１种ＴＦ(见表１)ꎮ所富集到的ＴＦ包含了ｂＺＩＰ(ＢａｓｉｃＬｅｕｃｉｎｅＺｉｐｐｅｒｆａｍｉｌｙ)㊁ＥＴＳ(Ｅ￣ｔｗｅｎｔｙｓｉｘ)㊁ＨＭＧ￣ｂｏｘ(ＨｉｇｈＭｏｂｉｌｉｔｙＧｒｏｕｐｂｏｘｆａｍｉｌｙ)㊁ＨＬＨ(ｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ￣ｌｏｏｐ￣ｈｅｌｉｘｆａｍｉｌｙ)㊁ＦＯＸ(Ｆｏｒｋｈｅａｄｂｏｘｆａｍｉｌｙ)㊁ＨＯＭＥＯ(Ｈｏｍｅｏｂｏｘｆａｍｉｌｙ)㊁ＮＨＲ(Ｎｕｃｌｅａｒｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆａｍｉｌｙ)㊁ＺＮＦ(Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｆａｍｉｌｙ)以及ｐ５３等各家族的ＴＦꎮ
表１　肺癌组织及癌旁组织转录因子鉴定对比
高可信度肽段数蛋白数转录因子数
肺癌组织９９１６１４３１２２３
癌旁组织８７５６１３８３１９１㊀㊀我们既往通过ｃａｔＴＦＲＥ对人类的ＨｅＬａ㊁ＭＣＦ￣７及小鼠的Ｍｉｌｉｖｅｒ等１１个细胞系的ＴＦ进行富集ꎬ每个细胞系在肽段萃取后分为１２个组分ꎬ质谱鉴定时间为１６小时ꎮ检测到单个细胞系的ＴＦ从２０７到４６０种ꎬ平均２９０种[１４]ꎮ同时ꎬ为了提高效率及节约经济成本ꎬ本研究中组织样品经肽段萃取后仅分为３个组分ꎬ质谱鉴定时间缩短为６小时ꎬ鉴定的
ＴＦ基本上就可以达到细胞水平ꎮ此外ꎬ由于ＴＦ在细胞内的表达丰度极低(仅占细胞总蛋白的０ ００１％~０ ０１％)[１４]ꎬ而本研究中每组鉴定到的ＴＦ的总量(ｉＢＡＱ)值约占每组鉴定到的蛋白总量的１０％以上ꎮ说明ｃａｔＴＦＲＥ确实可以对癌及癌旁组织中的ＴＦ进行有效富集ꎮ
二㊁差异表达蛋白及差异表达转录因子
应用基于强度的绝对定量方法(ｉＢＡＱ)ꎬ对鉴定到的蛋白质进行定量ꎬ依照两组间ｉＢＡＱ值之间的比值对蛋白及ＴＦ的表达量变化进行评定ꎮ肺癌组与癌旁组相比ꎬ表达上调的蛋白和ＴＦ(ｉＢＡＱ比值>３ꎬ同时鉴定到的肽段数>３个)分别有３７８种和有１０８(见表２)种ꎬ表达下调的蛋白和ＴＦ(ｉＢＡＱ比值小于０ ３３ꎬ同时鉴定到的肽段数>３个)分别有２４５种和５０种(见表３)ꎮ
对于这些差异表达的ＴＦꎬ通过查阅文献发现ꎬ有许多已经被报道与肺癌或者与肿瘤的发生发展相关ꎮ如ＵＨＲＦ１在多种癌症中过表达ꎬ以其在维持ＤＮＭＴ１介导的ＤＮＡ甲基化中的积极作用而闻名ꎬ并通过促进细胞增殖及在癌细胞的转移过程中发挥重要作用[１８]ꎮ有研究[１９]指出ＦＯＸＡ１通过转录调控网络来调节上皮－间质转化(ＥＭＴ)ꎬ在肺癌转移的早期是一种重要的负性调节剂ꎮＮＦＡＴｃ１是一种调节破骨细胞生成㊁Ｔ细胞发育和巨噬细胞功能的转录因子ꎮ通过以独立于ＴＧＦ￣β信号传导的方式上调转录抑制因子Ｓｎａｉｌ和Ｚｅｂ１来抑制Ｅ￣钙粘蛋白表达ꎬ促进肿瘤细胞的侵袭转移[２０]ꎮ这些差异表达的ＴＦ可能就是潜在的生物标志物或可作为治疗的靶点ꎬ也为接下来的大样本和深入研究指明了一些方向ꎮ
三㊁差异表达蛋白及转录因子的信号通路分析㊀㊀为了对肺癌组织及癌旁组织的分子特征得到更进一步的认识ꎬ我们对组织中差异表达蛋白及ＴＦ调节的信号通路进行了ＫＥＧＧ信号通路分析ꎬ结果显示ꎬ这些差异的表达蛋白及ＴＦꎬ除了在细胞质ＤＮＡ感应途径(ＣｙｔｏｓｏｌｉｃＤＮＡ￣ｓｅｎｓｉｎｇｐａｔｈｗａｙ)㊁Ｎｏｔｃｈ信号传导途径(Ｎｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ)㊁核苷酸切除修复(Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ)㊁错配修复(Ｍｉｓｍａｔｃｈｒｅｐａｉｒ)㊁基底转录因子(Ｂａｓａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ)㊁剪切体(Ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ)明显的富集现象之外ꎬ在ＶＥＧＦ信号通路(ＶＥＧＦｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ)㊁细
表２㊀上调ＴＦ
上调ＴＦｍｅａｎ￣ＴＰ上调ＴＦｍｅａｎ￣ｔＰＤＥＡＦ１３８３１４８４６４.５０.００３９３８３ＭＡＦＫ２４４７８５０２.０７０.００８６４７４４３ＭＸＤ４２４１７３８８８６.８０.００５１２２９２６ＥＬＦ１１１１７９８４４５.９０.００８４４５４０７ＦＯＸＡ１３８６３９７６.９０３０.００２５２６７０３ＨＭＧＢ１６５１２５９１５７.７０.００６８９４９６５ＳＯＸ２１６２２２９５８６９.８０.００７３０３０８２ＪＵＮＢ８７４２６２５６.８２０.００２８３１８８４ＣＲＥＢ１２３０７３２７３８.２０.００４５６１２２２ＭＥＦ２Ａ１６０１５０４９６.５０.００６８４０２２２ＣＵＸ１７７６４１７７.６４１０.００７０７１３１８ＰＫＮＯＸ１１９３９５１３３１.６０.００９６５６４５５Ｅ２Ｆ４３４４９２１１６.７２０.００９１０７１９４ＳＭＡＲＣＡ１１４０１６３３２.１２０.００６５２１５４３ＥＬＦ３３６４４５２９１.９３０.００１５９８３３６ＮＦＡＴｃ１５８１５４３０１１７０.００１６７３６９２ＥＴＳ１１７８８６０５.３０３０.００５５０２６２３ＳＴＡＴ１５６４７４９８２５８０.００１０３２７４４ＦＯＸＣ１６１６５５３.０１４０.００５９５３４９９ＮＲ２Ｆ１３３４３２１６４７８０.００１００４０１９ＦＯＸＣ２７６９７６１２７.６１０.００５３５９５６８ＨＭＧ２０Ａ１５３４１３４０４.５０.００９７０３９８９ＦＬＩ１４５９１３０８０８.３０.００６３０１９９３ＢＡＺ２Ａ２３７０４５６９０.９０.００２６１４２４５ＧＲＨＬ１１２６０７３２.９１４０.００２２２７６４７ＦＯＸＰ４７０８７５１７２７００.０００７０７１１９ＢＡＺ２Ｂ２２６４３０３７８.２０.００５０８１９２９ＦＯＸＦ１１７１４３６８１６００.００１０１５６０６ＨＭＧＢ２２５６０６６２５.６１０.００２１７８５５４ＭＡＦＦ１５６５７２８６.９８０.００１９８０４０１ＨＭＧＢ３５６３９８９３.９６３０.００７６６７９ＳＭＡＤ３１７３８２４４９２.３０.００６６４１４１７ＨＭＧＡ１２８５３６３９.５４０.００８７９６７６７ＮＦＩＡ９５０３９７８１４.７０.００９３６２８３６ＨＯＸＡ４１５９６６３５５６.９０.００４０７２１３９ＮＲＦ１３１１９０６７５３.８０.００２２４７８９ＨＯＸＡ５９１９６６３５.５９４０.００６５７７６７４ＹＢＸ１１５７７９４２６７.９０.００１７２８５５８ＨＯＸＡ１０９４４７９０５.７９０.００９４１４０１９ＰＯＵ２Ｆ１１１６９６３２１２３０.００２２３３６６１ＨＯＸＢ６６８７２２５５.５５５０.００９０４３６７７ＧＡＴＡＤ１１０６０５４８０１.６０.００９５２６１１８ＵＮＣＸ７３６１５４１１８.９０.００８６７８６７７ＲＦＸ１８７４１１６１.４０９０.００６９３５１５ＩＲＦ２８８０８７４６６.７８０.００８９３４４１７ＲＦＸ２６９８４５２６.７５５０.００４５６４６１６ＳＭＡＤ４３７８６８２３.９５４０.００８６６４３４５ＲＲＥＢ１６１５９８０３.０５０.００２３８４２９８ＦＯＸＯ４３６６２４７３０８.８０.００８４５４９２９ＨＮＦ１Ａ５６３８４１１６４.６０.００８３６１１５９ＡＴＦ１５５３４９０８８.６２０.００５０９４５４８ＮＫＸ２￣１２０３２８８７５２.７０.０００４０７６６１ＮＦＡＴＣ２４８８３２６９３９.５０.０００３８９０６８ＮＲ２Ｃ１２８６０１１５１７０.００１４１４５４８ＮＦＡＴＣ４５６７１４０１９６.９０.００９２２９９２５ＴＯＸ２７６１２４３０２８０.００２１３６５７７ＮＦＩＣ６８１８０１５５２.５０.００９９２４５７６ＭＴＡ２１１２７６６７８２.４０.００１２９４２２４ＰＢＸ３３０５３１５７５３.７０.０００７５８１８７ＴＢＸ４５７４７８９４０８.２０.００４６８６９５２ＬＥＦ１２１８１８３１９０.００２７０７１５５ＴＯＸ４１０９０７１９４９.４０.００３３５６５９４ＰＰＡＲＤ２５７６２４５４.５１０.００９４８９７７６ＣＥＢＰＺ１３３２４０２６３.５０.００８８９９８３５ＲＦＸ３１１２７５６３６.６７０.００７９７７８６６ＣＴＣＦ１１５５１７８７６.４０.０００２５１２５６ＵＨＲＦ１２８１３６２５６６.７０.００４５０４８９ＡＥＢＰ１８８０３９０４９１.９０.００３５７８６６４ＳＭＡＲＣＣ２１０３８９３８３１２０.００１０７１７９３ＢＨＬＨＡ１５５９５２７４６２.２５０.００６０２７３０１ＳＯＸ２４４３５１７１９４.６０.００５５８３７２７ＮＲ３Ｃ１２２４７４６９４１.６０.００４７８３２１９ＳＯＸ１５６７７３０９６.６２１０.００９９９９７４２ＨＥＳ１４８５８６５９９１.９０.００５８６６２０６ＳＴＡＴ３３０７０００４６７.７０.００３１１９５４９ＨＳＦ１７９２１９７３.４３８０.００６３９９４６６ＳＴＡＴ５Ｂ２４４４９１８９.８５０.００３４５５５４ＮＦＲＫＢ１８１０４１４０.２３０.００３７９１３１７ＴＢＸ２２７８７９６４７.９２０.００７７６３３３６ＮＦＹＣ２１５０５０９４.６５０.００８１０００２２ＴＢＸ３１８０１２００４４.５０.００３３１１７８２ＲＦＸ５２５６９６１２.１２０.００５７６６７６６ＴＣＦ１２５８１２７９２２８.６０.００７９７７１１１ＳＯＸ４１５３１４９２４２.８０.００３５５８２９５ＴＣＦ２１１５９３１４６４８.１０.００７６９６８１２ＴＢＰ９８１２２７８５０.４０.００５２７９７６ＴＥＡＤ１６３３６７４２.５０３０.００８９２６８３８ＨＮＦ１Ｂ２３１９００７０.７０.００４３３２６５２ＴＥＡＤ３２２１３１３９８７９０.００１４９５５８ＭＬＸ１３１６３９９４７.３０.００４４９３２８２ＮＲ２Ｆ２７２６０７２０４６.３０.００７６６３５５１ＴＦＣＰ２２４５２６４２４２.９０.００７４４７４４１ＴＦＤＰ１３５７１２５４２.９１０.００１１４７３５ＵＢＰ１２０３５７９８９.１８０.００７１００１６５ＴＨＲＡ１１３６６５５０５.２０.００３１０５０３６ＹＹ１３７２３６４５１.８９０.００４３８５６４７ＴＲＰＳ１１４２９７７６９.０９０.０００２４９７１６ＢＨＬＨＥ４０３０２２４６５２７.６０.００５３１６２１６ＳＳＸ３１８７８３１６５.４６０.００２９１３８２７ＲＵＮＸ１２３６４３８８１.５９０.００７６５６８６５ＵＳＦ２８３３４７６.３７７１０.００５４２７７８４ＲＵＮＸ３２５６９２６１９.４９０.００１４２０６８４ＥＳＲＲＡ１２９８９８２１.４６０.０００７４５７６３ＣＢＦＢ１５１２７３３９.７６０.００４２８３７４ＺＮＦ１４８９２９３１００２.５８０.００７４３００９１ＦＯＳＬ２３３６００５２３６０.０００４６７９３２ＢＨＬＨＥ４１６３３２３６１９.９９０.０００６１２９３６ＨＭＢＯＸ１１７１２７７９４１.５０.０００１２５６１
表３㊀下调ＴＦ
下调ＴＦｍｅａｎ￣ＴＰ下调ＴＦｍｅａｎ￣ＴＰＺＦＨＸ３２３３８０６４５７.６０.００５４０８０３１ＡＤＮＰ６３６６３７７４８.６０.００４９７８１４３ＮＦＡＴＣ３４３９２９４６２１.５０.００６１８０３３８ＥＨＦ８２９３４５５０７.５０.００８１４６９４９ＺＮＦ６９１２９８２２７８０２.５０.００８８０２６２ＳＭＡＲＣＣ１２０３７４９１６５.９０.０００３３０６２５ＰＯＵ３Ｆ２７２３２３０８４５.６０.００２６９３１０２ＳＭＡＲＣＥ１１２７５５０６９８.９０.００２２３９５０３ＰＰＡＲＧ５１１７７１３７.９４０.００６７０４１７３ＳＩＸ４７３９８８５９６２９０.００９４７３２８９ＭＴＡ３４１１５５８５.０３４０.００６３４３８４ＴＦＡＭ７７２８９０４２７.４０.００８５６８３７２ＲＸＲＡ５２２０５４６３８.３０.００３９２９５２ＶＤＲ２４４３９０７６.９２０.００９９２３４６９ＳＩＸ１１０９８６７９７３５０.００２９２２３２１ＸＢＰ１８６３２６８２２.６０.００８４７５１６２ＴＣＦ７Ｌ２１８８３９７１４０.７０.００９２７９２６４ＺＮＦ２２５５６７４３５７.３４０.００７５２８３５５ＴＣＦ２０８２８１４９６４４.２０.００２１２４８３８ＺＮＦ２０７９６１５５３１９.２６０.００８５６９０４９ＴＦＡＰ２Ａ２５２５１６８１２.８０.００９３８２９ＰＡＸ８４０５７０２４４７３０.００７５２８２６３ＴＧＩＦ１１３１３６７４５５０.００８８５３４４４ＹＥＡＴＳ４９３３５２４４５１.２０.００１３６９９０１ＮＲ２Ｃ２２７０３９３００.６０.００５９５８４１５ＡＲＩＤ１Ａ３１５５４８１１０.６０.００３０９００４７ＭＴＡ１３３７７５９０５.３２０.００４２４１５７２ＭＡＦＢ４９８１６４００７０.０００３１２２１ＦＯＸＰ２３７５４５９８１５１０.００２８１０６１ＭＲＰＬ２８７１９２１２４１０.２０.０００１９４８８７ＤＲＡＰ１４４４５７８９６７.５０.００５３４８６２１ＮＲ４Ａ１７３２９８７０８４.７０.００９５１０７８３ＡＴＦ７５４１０６４９９.０８０.００６２４７７５４ＰＲＲＸ１３７７１０６８７１.３０.００５７１００７１ＤＢＰ１４４０１８０８８０.００９３６２６７５ＲＢＬ２１３３４０３２１.７３０.００５６９５９９１Ｅ２Ｆ１６４８１２４３６８.３０.０００５０３６１２ＮＯＣ３Ｌ５２６２１２９１０６０.００３０３１０５５ＥＬＦ４２２３６０７３０２７０.００３４０８１７９ＵＢＴＦ１６３６８３６０９２０.００３６６４９７７ＥＬＫ１４１４９６７６８４.９０.０００８３５８２３ＥＬＫ３１２２３５７３５２.８０.００１１８３２３８ＥＴＶ６５４１１７９９６９.６０.００９８４３０８９ＥＲＧ４２０００５.７７６８０.００８６０５７０２ＢＰＴＦ８３７６０１０６４.３０.００３４６１６８７ＲＥＬＢ４６１５３２５１.０４０.００３０５５６１８ＭＬＸＩＰ１６１２５０９６２.１０.００１３８６２７４ＰＲＤＭ１６７４０３１８２.７３２０.００９９３３１３１ＭＧＡ８２９５１１８２７.３０.００５６９２５７ＳＫＩ７７３０５８４５.５６０.００２６６３７７９
胞周期(Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ)㊁癌症转录失调(Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒ)等也有明显的富集现象ꎮ对于上述信号通路ꎬ有些与肿瘤的发生发展相关ꎬ有些被运用到抗肿瘤的策略中ꎮ如研究已证实ＶＥＧＦ信号通路参与肿瘤周围新生内皮细胞的迁移㊁增殖ꎬ在肿瘤周围血管新生的过程中具有重要的作用ꎮＶＥＧＦ受体信号转导途径可作为抗肿瘤治疗方案的理想靶点[２１]ꎮ又如Ｎｏｔｃｈ信号通路是一条决定细胞命运㊁保守而重要的信号转导通路ꎬ影响发育过程中多种细胞的分化㊁增殖和凋亡ꎬ研究发现其与肺癌的发生㊁发展相关[２２]ꎮＴＦ在大多数人类癌细胞中过分活跃ꎬ这让他们成为抗癌药物的开发的目标ꎮ研究差异表达蛋白及ＴＦ的信号通路ꎬ说明它们的确起着关键的作用ꎬ为未来深入的研究提供了一些重要的依据ꎮ
讨㊀㊀论
近年来随着对肺癌研究的不断深入ꎬ对其病因㊁发生发展㊁治疗及预后知识不断更新ꎮ除了形态学特征之外ꎬ近年来越来越多的研究致力于寻找能评估和预警肺癌术后转移和复发的分子标记物㊁筛选可以为肺癌个体化治疗提供依据的靶点ꎬ与肺癌相关的分子生物学研究成为肺癌研究的热点ꎮ
㊀㊀低丰度的ＴＦ中蕴含着丰富的与疾病相关的病理信息ꎬ通过确保特定基因的正确表达ꎬ转录调控系统在控制许多生物过程中起着核心作用ꎬ但在样品的处理过程中ꎬ由于与容器表面发生非特异性结合及其他溶剂的稀释ꎬ低丰度的蛋白在分离和检测前就已经丢失ꎬ如何将其从高丰度的蛋白中分离出来并进行鉴定一直是困扰着我们的一个问题ꎮ经过不断的尝试与努力ꎬ我们研发的ｃａｔＴＦＲＥ技术ꎬ极大的提高了ＴＦ的富集效率及鉴定效率ꎮ本研究证实了在组织水平上ｃａｔＴＦＲＥ技术同样可以高效富集和鉴定ＴＦꎬ为接下来大样本㊁高数量鉴定肺癌组织的ＴＦ提供了技术支持ꎮ本研究还对差异表达的ＴＦ及蛋白做了ＫＥＧＧ通路分析ꎬ发现一些通路的确与一些肿瘤相关ꎬ而这些ＴＦ及相关通路可能就是我们未来研究的方向ꎬ或许我们可以从中找到肺癌发生发展甚至新的治疗策略的突破口ꎮ
㊀㊀综上所述ꎬ本研究提供的一种高效富集肺癌及癌旁组织转录因子的方法￣ｃａｔＴＦＲＥ技术ꎬ并根据富集到的ＴＦ及蛋白复合物ꎬ对肺癌与癌旁组织差异
表达ＴＦ和蛋白的分析ꎬ我们发现一些ＴＦ在肺癌的发生㊁发展的过程中起到调控作用ꎬＴＦ的表达变化ꎬ可能使一些与细胞生长㊁分裂和增殖有关的蛋白异常表达而导致增殖失控㊁凋亡受阻以及侵袭与转移等ꎬ使细胞在整个调控网络上表现出与正常细胞的许多区别ꎬ最终引起肺癌的发生ꎮ通过对肺癌组织及癌旁组织ＴＦ的鉴定及分析研究ꎬ有助于解释ＴＦ与肺癌发生之间的关系ꎬ为未来对大规模肺癌的深入研究提供一些重要的依据和基础ꎮ
参考文献
[１]㊀ＳＩＥＧＥＬＲＬꎬＭＩＬＥＲＫＤꎬＪＥＭＡＬＡ.Ｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓꎬ２０１８[Ｊ].
ＣＡＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎꎬ２０１８ꎬ６８(１):７－３０.
[２]㊀ＣＨＥＮＷꎬＺＨＥＮＧＲꎬＢＡＡＤＥＰＤꎬｅｔａｌ.ＣａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｉｎＣｈｉ￣ｎａꎬ２０１５[Ｊ].ＣＡＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎꎬ２０１６ꎬ６６(２):１１５－１３２. [３]㊀ＣＨＥＮＷＱꎬＬＩＨꎬＳＵＮＫＸꎬｅｔａｌ.ＲｅｐｏｒｔｏｆＣａｎｃｅｒＩｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄＭｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＣｈｉｎａꎬ２０１４[Ｊ].ＺｈｏｎｇｈｕａＺｈｏｎｇＬｉｕＺａＺｈｉꎬ２０１８ꎬ４０(１):５－１３.
[４]㊀ＡＬＬＥＭＡＮＩＣꎬＭＡＴＳＵＤＡＴꎬＤＩＣＡＲＬＯＶꎬｅｔａｌ.Ｇｌｏｂａｌｓｕｒｖｅｉｌ￣ｌａｎｃｅｏｆｔｒｅｎｄｓｉｎｃａｎｃｅｒｓｕｒｖｉｖａｌ２０００￣１４(ＣＯＮＣＯＲＤ￣３):ａｎａｌｙ￣ｓｉｓｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｒｅｃｏｒｄｓｆｏｒ３７５１３０２５ｐａｔｉｅｎｔｓｄｉａｇｎｏｓｅｄｗｉｔｈｏｎｅｏｆ１８ｃａｎｃｅｒｓｆｒｏｍ３２２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ￣ｂａｓｅｄｒｅｇｉｓｔｒｉｅｓｉｎ７１ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ[Ｊ].Ｌａｎｃｅｔꎬ２０１８ꎬ３９１(１０１２５):１０２３－１０７５.
[５]㊀ＹＯＮＧＣＳＭꎬＤＡＲＤＡＬＨＯＮＶꎬＤＥＶＡＵＤＣꎬｅｔａｌ.ＣＡＲＴ￣ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｏｆｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓ[Ｊ].ＩｍｍｕｎｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０１６ꎬ９５(４):３５６
－３６３.
[６]㊀ＰＥＴＴＩＴＴＤꎬＡＲＳＨＡＤＺꎬＳＭＩＴＨＪꎬｅｔａｌ.ＣＡＲ￣ＴＣｅｌｌｓ:ａＳｙｓｔｅｍ￣ａｔｉｃＲｅｖｉｅｗａｎｄＭｉｘｅｄＭｅｔｈｏｄｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌＬａｎｄｓｃａｐｅ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒꎬ２０１８ꎬ２６(２):３４２－３５３. [７]㊀ＢＯＵＳＳＩＯＴＩＳＶＡ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｔｈｅＰＤ￣１ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０１６ꎬ３７５(１８):１７６７－１７７８.
[８]㊀ＨＥＲＢＳＴＲＳꎬＢＡＡＳＰꎬＫＩＭＤＷꎬｅｔａｌ.Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂｖｅｒｓｕｓｄｏ￣ｃｅｔａｘｅｌｆｏｒｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｔｒｅａｔｅｄꎬＰＤ￣Ｌ１￣ｐｏｓｉｔｉｖｅꎬａｄｖａｎｃｅｄｎｏｎ￣ｓｍａｌｌ￣ｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ(ＫＥＹＮＯＴＥ￣０１０):ａｒａｎｄｏｍｉｓｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ[Ｊ].Ｌａｎｃｅｔꎬ２０１６ꎬ３８７(１００２７):１５４０－１５５０. [９]㊀ＥＩＧＥＮＴＬＥＲＴＫꎬＨＡＳＳＥＬＪＣꎬＢＥＲＫＩＮＧＣꎬｅｔａｌ.Ｄｉａｇｎｏｓｉｓꎬｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｉｍｍｕｎｅ￣ｒｅｌａｔｅｄａｄｖｅｒｓｅｄｒｕｇｒｅａｃ￣ｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉ￣ＰＤ￣１ａｎｔｉｂｏｄｙｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ/ＯＬ].ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔＲｅｖꎬ２０１６ꎬ４５:７－１８[２０１９－０８－０８].ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎ￣ｔｒｅｖｉｅｗｓ.ｃｏｍ/ａｒｔｉｃｌｅ/Ｓ０３０５－７３７２(１６)０００１８－９/ｆｕｌｌｔｅｘｔ.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｔｒｖ.２０１６.０２.００３.[１０]ＳＨＡＲＭＡＰꎬＨＵ￣ＬＩＥＳＫＯＶＡＮＳꎬＷＡＲＧＯＪＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｉｍａｒｙꎬａ￣ｄａｐｔｉｖｅꎬａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].
Ｃｅｌｌꎬ２０１７ꎬ１６８(４):７０７－７２３.
[１１]ＺＨＯＮＧＷＺꎬＣＨＥＮＫＮꎬＣＨＥＮＣꎬｅｔａｌ.ＥｒｌｏｔｉｎｉｂＶｅｒｓｕｓＧｅｍ￣ｃｉｔａｂｉｎｅＰｌｕｓＣｉｓｐｌａｔｉｎａｓＮｅｏａｄｊｕｖａｎｔＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＳｔａｇｅⅢＡ￣Ｎ２ＥＧＦＲ￣ＭｕｔａｎｔＮｏｎ￣Ｓｍａｌｌ￣ＣｅｌｌＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ(ＥＭＥＲＧＩＮＧ￣ＣＴＯＮＧ１１０３):ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅⅡｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌꎬ２０１９ꎬ３７(２５):２２３５－２２４５.
[１２]ＡＣＣＩＬＩＤꎬＡＲＤＥＮＫＣ.ＦｏｘＯｓａｔｔｈｅｃｒｏｓｓｒｏａｄｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｔａｂ￣ｏｌｉｓｍꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００４ꎬ１１７(４):４２１－４２６.
[１３]ＶＡＱＵＥＲＩＺＡＳＪＭꎬＫＵＭＭＥＲＦＥＬＤＳＫꎬＴＥＩＣＨＭＡＮＮＳＡꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｎｓｕｓｏｆｈｕｍａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ:ｆｕｎｃｔｉｏｎꎬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔꎬ２００９ꎬ１０(４):２５２－２６３. [１４]ＤＩＮＧＣꎬＣＨＡＮＤＷꎬＬＩＵＷꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｔｅｏｍｅ￣ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆａｃ￣ｔｉｖａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｗｉｔｈａｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄｔａｎｄｅｍａｒｒａｙｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬ２０１３ꎬ１１０(１７):６７７１－６７７６.
[１５]ＺＯＲＴꎬＳＥＬＩＮＧＥＲＺ.ＬｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢｒａｄｆｏｒｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｔｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ:ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].
ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ１９９６ꎬ２３６(２):３０２－３０８.
[１６]ＳＣＨＷＡＮＨ?ＵＳＳＥＲＢꎬＢＵＳＳＥＤꎬＬＩＮꎬｅｔａｌ.Ｇｌｏｂａｌｑｕａｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１１ꎬ４７３(７３４７):３３７－３４２.
[１７]ＶＥＮＴＥＲＪＣꎬＡＤＡＭＳＭＤꎬＭＹＥＲＳＥＷꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ２９１(５５０７):１３０４－１３５１. [１８]ＭＵＤＢＨＡＲＹＲꎬＨＯＳＨＩＤＡＹꎬＣＨＥＲＮＹＡＶＳＫＡＹＡＹꎬｅｔａｌ.
ＵＨＲＦ１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｒｉｖｅｓＤＮＡｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｈｅｐａｔｏ￣ｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ２５(２):１９６－２０９. [１９]ＷＡＮＧＨꎬＭＥＹＥＲＣＡꎬＦＥＩＴꎬｅｔａｌ.Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｉｄｅｎ￣ｔｉｆｉｅｓＦＯＸＡ１ａｓａｋｅｙｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｌｏｓｓｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｒａｉｔｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ￣ｔｏ￣ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１３ꎬ１４:６８０.
[２０]ＯＩＫＡＷＡＴꎬＮＡＫＡＭＵＲＡＡꎬＯＮＩＳＨＩＮꎬｅｔａｌ.Ａｃｑｕｉｒｅｄｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｏｆＮＦＡＴｃ１ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓＥ￣ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＲｅｓꎬ２０１３ꎬ７３(１６):５１００－５１０９. [２１]ＡＢＤＥＬ￣ＲＡＨＭＡＮＯ.Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ(ＶＥＧＦ)ｐａｔｈｗａｙｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ:ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｌＨｅｍａｔｏｌꎬ２０１５ꎬ９３(１):１８－２７.
[２２]ＤＯＮＮＥＭＴꎬＡＮＤＥＲＳＥＮＳꎬＡＬ￣ＳＨＩＢＬＩＫꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｉｍ￣ｐａｃｔｏｆＮｏｔｃｈｌｉｇａｎｄｓａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ:ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｏｔｃｈ￣１ａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ￣Ａｐｒｅｄｉｃｔｓｐｏｏｒｓｕｒｖｉｖａｌ[Ｊ].Ｃａｎｃｅｒꎬ２０１０ꎬ１１６(２４):５６７６－５６８５.
[收稿日期:２０１９－０８－０８]。