何首乌饮对衰老大鼠肾脏CD26表达的影响

Science &Technology Vision 科技视界随着经济社会的持续发展,人类寿命不断延长,社会老龄化问题日益加剧[1]。

到2020年,我国老年人口将达到2.5亿[2]。

自40岁开始,人类肾脏开始衰老[3]。

伴随着肾脏重量减少,功能健全的肾小球逐渐减少。

流行病学调查显示,慢性肾脏疾病(CKD)患病率随增龄而大幅度增加[4]。

何首乌饮是祖国医学的奇葩。

具有保护肾脏,延缓衰老作用[5]。

面对衰老带来的诸多社会医学问题,开展老年医学研究,探讨何首乌饮延缓衰老机制,对临床有一定的指导意义。

CD26是白细胞分化抗原之一,具有独特的二肽基肽酶IV 活性,可以分解N 端第2位脯氨酸的多肽物质生成一段两肽[6]。

CD26对含有脯氨酸的多肽在肾脏的转运以及肠道中的消化过程中起着重要作用。

1材料与方法
1.1实验动物
体重200-220g 雄性Wistar 大鼠30只(由河北医科大学实验动物学部提供)12月龄大鼠10只,18月龄大鼠20只。

1.2何首乌饮方剂组成
何首乌(炙)、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓按质量比3:2:3:2:5:3比例混合,水浸泡1小时,水煎2次,30分钟/次,过滤后浓缩至含生药4.8g*ml -1,4℃保存,给药前复温至25-30℃[7-8]。

1.3主要实验试剂
兔抗鼠CD26一抗,SABC(兔IgG)-POD Kit 试剂盒,恒温箱。

1.4实验方法
30只大鼠适应性饲养1周后分组,10只12月龄大鼠作为青年对照组,20只18月龄大鼠按随机数字表法分为自然衰老模型组和何首乌饮干预组。

全程给予普通饮食,何首乌饮干预组第二天开始每天给予何首乌饮1ml/100g 灌胃,自然衰老模型组给予等量生理盐水灌胃。

共60天。

实验期间动物自由进食、饮水、活动。

1.5标本收集
最后一次灌胃4小时后断头处死大鼠,取肾脏中性甲醛固定,常规脱水。

1.6免疫组化法观察CD26在肾脏分布
从4%中性甲醛中取出肾组织,经脱水机脱水后,包埋制成蜡块,将蜡块切成大约4um 的切片以备用。

切片经烤片30min 后经三次二甲苯和三次乙醇中脱蜡至水,3%过氧化氢室温处理10分钟,灭活过氧化氢酶,用PBS 洗3次。

热修复抗原,将切片浸入0.01M 柠檬酸钠
缓冲液(pH6.0),微波炉加热至沸腾后断电,6分钟后,反复此次操作。

冷却后PBS(pH7.0)洗涤3次[9]。

比例稀释,滴加稀释的一抗37℃孵育1小时。

PBS(pH7.2)洗涤3次,每次2分钟。

用稀释滴加5%BSA 封闭液,室温20分钟,甩去多余液体。

用稀释液将一抗按一定液将Bio-羊抗兔IgG 浓缩液按1:100稀释成工作液,滴加Bio-羊抗兔IgG 工作液,37℃孵育30分钟,PBS (pH7.2)洗涤3次,每次2分钟。

用稀释液将SABC-POD 浓缩液按1:100稀释成工作液,滴加SABC-POD 工作液,37℃孵育30分钟,PBS (pH7.2)洗涤4次,每次5分钟。

DAB 显色,室温显色,镜下控制反应时间,20分钟后,蒸馏水洗涤终止反应。

苏木素复染。

依次加稀盐酸乙醇,稀氨水,水洗10分钟。

脱水:80%乙醇2分钟,90%乙醇2分钟,95%乙醇3分钟,无水乙醇5分钟,无水乙醇5分钟;二甲苯5分钟2次。

晾干。

烤箱60℃2分钟。

滴加中性树胶,盖上盖玻片封片。

显微镜观察。

200倍光镜下记录每张切片阳性细胞数,每个标本随机取5个视野将其阳性细胞的均数作为表达数[10]。

2结果
(1)各组大鼠一般情况:青年对照组大鼠活泼,何首乌饮干预组大鼠毛色稍暗,活动可,自然衰老对照组大鼠毛色枯黄,懒动。

(2)免疫组化结果显示:与青年对照组相比,CD26+T 细胞在衰老对照组大鼠肾脏间质明显聚集(P<0.05),在何首乌饮干预组聚集程度较衰老对照组明显减少(P<0.05)。

图1
3讨论
CD26由二个同源亚单位组成,通过N 端亲水区粘附于细胞膜上。

又称二肽酰肽酶IV,是一种高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白,CD26是一种丝氨酸蛋白水解酶,可以在多肽的倒数第二个L-脯氨酸或L-丙
何首乌饮对衰老大鼠肾脏CD26表达的影响
赵荣慧1郑立双2马连顺3牛嗣云3
(1.河北大学附属医院临床药学室,河北保定071000;2.河北大学附属医院中心实验室,河北保定
071000;3.河北大学基础医学院,河北保定071000)
【摘要】目的:探讨CD26在自然衰老大鼠肾组织中的表达,及何首乌饮对自然衰老大鼠肾组织CD26的影响。

方法:Wistar 大鼠动分组:青年对照组(12月龄)大鼠10只,自然衰老对照组(18月龄)大鼠10只,何首乌饮干预组(18月龄)大鼠10只,何首乌饮灌胃60天。

免疫组化法观察CD26在肾脏分布。

结果:何首乌饮干预组的肾小球数目明显高于自然衰老对照组(P<0.01),与青年组接近;CD26在老年对照组大鼠肾组织的表达较青年对照组明显增强,何首乌饮干预组其表达显著下降(P<0.05)。

结论:何首乌饮减弱自然衰老大鼠肾脏CD26的表达,具有延缓衰老作用。

【关键词】抗原;Cd26;衰老;肾脏疾病;何首乌饮
【Abstract 】Objective:To investigate the expression of CD26in the kidney tissues of aging rats and the effects of Heshouwuyin on the renal CD26expression.Methods:Wistar rats were divided into three groups:natural young group (NY group,12months,n=10),natural aging model group(NA group,18mongths,n=10)and Heshouwuyin-treated aging group (HT group,18months,n=10).NA wistar rats were fed with 0.9%NaCl.HT wistar rats were fed with Heshouwuyin for sixty days.The slices of kidney were made by histological method and stained by HE staining.The morphological changes of kidney were observed under microscope and quantitatively analyzed.The expression of CD26in kidney was examined by using immunohistochemistry.Results The kidney glomerulus number of rats in HT group was higher than in NA group and approach NY rats (P <0.01);the renal capsule breadth and the kidney glomerulus diameter were obviously lower than NA group (P <0.01).Compared with NY group,CD26were significantly increased in NA group(P<0.01).CD26in renal tissue was mainly expressed in T lymphocytes of renal interstitium.CD26expression in NA group was significantly higher than that in NY group,and also higher than that in HT group (P<0.01).In HT group,CD26+T lymphocytes infiltration of renal interstitium was positively correlate NY group.Conclusions:CD26is related with aging nephropathy.Heshouwuyin maybe inhibit T lymphocytes infiltration to reduce the expression of CD26in renal interstitium,thus protecting the kidney function and delay renal senility of rats.
【Key words 】Antigens;CD26;Aging;Kidney diseases;Heshouwuyin (c )HT(何首乌干预组)
(a )NY(青年对照组)(b )NA(老年对照组)243
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界表2干扰实验结果
注:表内数值表示干扰物对试剂干扰超过试剂的最大干扰偏差(10%)的最低浓度.
4结论
胆红素氧化法的原理是在pH=3的条件下,血清胆红素可以经钒酸盐氧化成胆绿素。

从而使胆红素特有的黄色减少,可根据其吸光度下降的差值来计算出胆红素浓度。

亚硝酸盐氧化法的原理是在适合的缓冲液中加入特定的加速剂,使血清胆红素被反应介质中新生成的亚硝酸氧化成淡绿色化合物,引起胆红素吸光度下降。

精密度测试结果中,亚硝酸盐氧化法对低值的测试比钒酸盐氧化法较好,但在测试高值的时候就没有这些差别了,可能是因为钒酸盐自带的淡黄色的照成试剂空白吸光度稍大于实际值。

其影响在可接受范围内,精密度CV 值均在5%以内,准确度偏差也在范围内。

钒酸盐氧化法试剂在
(0-700μmol/L)范围内结果良好。

亚硝酸在(0-500μmol/L)范围内结果
也可接受,但对更高的值进行测试时已经偏差较大,不推荐使用。

因此在测定范围上,钒酸盐氧化法试剂要明显优于亚硝酸氧化法试剂。

两试剂的干扰筛选结果是一致的,肝素对两试剂干扰效应也一致。

但是抗坏血酸与血红蛋白对亚硝酸盐氧化法试剂的干扰效应要比对钒酸盐氧化法试剂的强。

由于条件限制,不能使用更多的干扰物进行实验,但总体来说,钒酸盐氧化法试剂的抗干扰能力要大于亚硝酸氧化法试剂。

[1]曾东良.钒酸盐氧化法与干化学法测定总胆红素的方法学比较[J].华夏医学,2005,18(1):33-35.
[2]Daniel W.T.,Anders K,John W.K.,et al..Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods[S].NCCLS Document EP5-A2,2004,24(25):8-14.
[3]Daniel W.T.,Martin K.,J.Rex A.,et al..Evaluation of the Linearity of Quantita⁃tive Analytical Methods[S].NCCLS Document EP6-A,2003,23(16):10-16.
[4]Donald M.P.,James C.B.,Melvin R.G.,et al..Interference Testing in clinical Chemistry[S].NCCLS Document EP7-A,2002,22(27):25-30.
[责任编辑:汤静]
肝素(U/L)
抗坏血酸(g/L)血红蛋白(g/L)方法低值高值低值高值低值高值钒酸盐法112013400.350.35 4.0 4.0亚硝酸盐法1120
1340
0.20
0.20
2.5
2.0
氨酸处,切除N-末端的二肽。

[11]
CD26的底物包括一大类含有脯氨酸的肽,如生长因子、趋化因子、神经肽及血管活性肽。

CD26参与免疫调节、信号转导及细胞凋亡,并在肿瘤的发展过程中发挥重要作用。

[12]
肾间质是位于肾单位与集合管之间的结缔组织,内含细胞纤维和基质部分,对肾血管起着支持作用[13]。

有研究表明,CD26在糖尿病肾脏小鼠肾间质T 细胞有明显浸润,它是T 细胞活化的辅助分子,CD26分子的广泛交联能导致T 细胞的直接激活。

CD26以膜结合形式分布于多种细胞的Ⅱ型跨膜糖蛋白,具有蛋白水解作用。

CD26是一种多功能蛋白,是细胞膜受体和共刺激分子,参与机体的免疫调节、细胞凋亡、细胞黏附、等过程[12]。

我们研究发现,在衰老大鼠肾脏间质,CD26高表达。

在T 细胞识别抗原过程中,CD26提供共刺激信号,辅助T 细胞活化。

本研究证实CD26与CKD(慢性肾脏疾病)具有相关性,何首乌饮对衰老大鼠肾脏的干预可能通过抑制T 淋巴细胞增殖减少CD26在肾间质的表达,从而起到保护肾脏,延缓衰老作用。

[1]陈香美,孙雪峰.共同参与有效防治老年肾脏病[J].中华医学信息导报,2014-3-12,29(14).
[2]顾勇.老龄肾脏病的重要性和诊治特点[J].老年医学杂志,2011,17(5):257-258.
[3]张望,MarcelloTonelli,Miguel Riella.慢性肾脏病与人口老龄化[J].中华肾脏病杂志,2014,2,30(2):81-84.
[4]王芳,王海燕.老年慢性肾脏病的防与治[J].中华医学信息导报,2014-3-12,29(5):15.
[5]李文斌,崔美玉,许冬梅,关广聚.二肽基肽酶IV 活性对糖尿病肾病进展的影响[J].中华肾脏病杂志,2010,2,26(2):137-138.
[6]张志珍,毛积芳,刘智慧.二肽基肽酶IV 的结构与功能[J].生命的化学,2001(5):381-383.
[7]陈俊香.衰老相关B-半乳糖苷酶在老年大鼠肾脏组织中的变化和意义[J].临床医学研究,2009,26(11):2022-2025.
[8]陈雪,牛嗣云.何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响[J].时珍国医国药,2009,20(3):650-651.
[9]耿广琴,杨雅丽,王晶,黄勇.党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝肾SOD 活性、MDA 含量及超微结构的影响[J].中医研究,2014,27(7):70-74.
[10]马鹤超,庞晓静
.何首乌饮对衰老大鼠肾脏TGF-β1和TIMP-1表达的影响[J].承德医学院学报,2009,3(3):248-250.
[11]孙涛,李艳华.CD26与ADA 结合活化肾癌细胞内TGF-β调控肾癌细胞迁移能力的研究[J].牡丹江医学院学报
,2013,34(3).
[12]姜祥品,郭红岩.霉酚酸酯对糖尿病大鼠肾脏CD26表达的影响[J].中华肾病杂志,2014,30(8):592-597.
[13]王海燕.内科学[M].北京大学医学出版社658.
[责任编辑:薛俊歌]
(上接第94页)外,更需要用人单位在事业平台、
条件保障、团队配备、启动经费等各方面的支持,加大配套支撑力度,从而能够充分地发挥才能,高效率、安心工作,积极奉献。

不但是对人才的尊重,也是对国家利益的回报。

总之,“千人计划”吹响了中央层面引进海外高层次人才的号角,这是一项长期、全局的国家级人力资源开发专项工作,需要各部门的协调配合、循序渐进、宁缺毋滥,更注重实践人才。

同时对于海外高级人才加强思想建设,弘扬社会主义核心价值观,早日实现国家富强、民
主振兴、人民幸福、中华民族伟大复兴的中国梦。

[1]汪燕,牟眸.实现“千人计划”的乘数效应[J].浙江经济,2012(10).[2]李宁.“千人计划”政策之我见[J].
人力资源,2009(4).
[3]王荷风,李小跃,高宏,谢保军.从“千人计划”人才的引进谈国内高校引人才环境的创建[J].中国高校师资研究,2010(5).
[责任编辑:薛俊歌]
(上接第183页)藏慧轩中有趣的日历是课程内容在区角内的延伸,通过再一次的实践、操作,让孩子进一步了解日历中的秘密。

3思与惑
从区域活动入手,激发幼儿的创造能力,对于幼儿更好的学习和生活都有着很大的影响。

如何在区域活动中更好地拓展教师对创新性思维的培养研究,值得我们在不断的实践教学中去探索和研究。

[1]王炳忠.浅谈学生的创新思维培养[J].新课程教育研究,2013(34).
[2]姚清,郭倩倩.主题活动下小班幼儿区域活动初探[J].新课程教育研究,2013(34).
[3]宁波市教育局教研室.宁波市幼儿园保教工作手册[Z].
[责任编辑:薛俊歌]
(上接第242页)
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