酵母双杂交系统的原理及应用

酵母双杂交系统的原理及应用
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。

典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。

因此，在GAL4-ad 氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。

同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母三双杂交系统
三杂交系统(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA间的相互作用。

Senguptaxi等首先报道了应用三杂技系统分析金属调节蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)与金属反应元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV转录激活蛋白(trans-activator protein，Tat)与HIV转录激活反应元件(HIV trans-activation response
element，TAR)RNA序列间的作用。

三杂交系统的基本原理是将一个已知的RNA结合蛋白与转录因子的DNA结合domain(如LexA)构建第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的RNA结合蛋白)与转录激活结构域构建融合蛋白。

此外构建和表达一杂合RNA，含有二个不同的结合位点。

当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。

如Dhruba等在IRP1与IRE的RNA相互作用的研究中，第一个RNA结合蛋白选用噬菌体MS2被壳蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可识别RNA中的21nt的茎环序列，并与之有较高的亲和力。

将其与LexA融合构建杂合蛋白。

IRP1与Gal4的激活结构域(activation domain)融合构建另一个杂合蛋白。

IRE mRNA在非编码区有21nt的茎环区序列，编码区编码与IRP1特异性结合的蛋白序列。

在实验中他们用一质粒表达杂交RNA，含2个MS2 coat protein结合位点和1个IRE。

三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-蛋白间相互作用的新方法。

与双杂交系统相比，杂交RNA与杂交蛋白有些不同：首先，杂交RNA分子可能不是生理结构，杂交的不同RNA组分对正常结构会有一定影响。

但Dhruba的研究表明，局部、相对稳定的结构区如MS2 coat protein，IRP1识别位点等可在体内共存于同一杂交RNA分子中。

其次，这些RNA中的茎环区结构相当稳定，RNA只要形成部分正确结构，则足以介导转录激活作用。

象双杂交系统一样，三杂交系统具有广泛的应用。

〈1〉应用此系统可分析确定RNA--蛋白作用的精确结构域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基。

〈2〉用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(如转录、定位、RNA病毒包装和感染等)的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。

〈3〉通过构建杂交RNA库，可筛选与特定蛋白结合的RNA。

〈4〉有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNA间的相互作用。

反向酵母双杂交系统
确定了蛋白之间的相互作用后，更重要的工作是研究其功能、结构及其作用的条件调节。

鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的抑制作用，不仅有助于探索相互作用的结构单位，而且可作为研究体内功能的遗传学方法。

这对于多个作用分子的蛋白就更为重要。

1996年Vidalix x等建立了反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)，提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。

反向酵母双杂交系统的关键是掺入一种表达产物对细胞生长有毒的报导基因，用于监测蛋白间的相互作用。

例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的，同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。

Vidal等构建了一酵母细胞株，其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。

此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。

而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。

因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。

反向双杂交系统可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系。

此外此系统还可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。

酵母双杂交系统的建立与发展
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。

细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。

80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。

而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。

如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。

Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。

他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。

由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。

如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。

这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。

通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。

这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。

而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。

已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。

结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。

目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。

这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。

其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。

经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。

HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。

大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。

这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。

通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。

其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。

而且, 酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。

因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。

Bendixen等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率。

在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型, 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。

根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, “诱饵”表达载体转化a接合型细胞。

然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。

单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融
合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。

长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。

这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。

针对实际工作中的这种需要, Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)］。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入。

URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。

Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。

这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。

在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。

然而如果目的蛋白, 即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。

通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。

结果得到了体外结合实验的验证。

通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。

以上介绍的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶II的激活的基础上的。

这意味着双杂交过程是在细胞核内完成的。

然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白, 它们需定位到膜上之后才能表现正常的生物功能，与其他蛋白质起作用。

有些真核细胞蛋白还要经过翻译后的加工修饰如二硫键的形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。

这些加工修饰在正常的细胞核内不可能发生。

有些蛋白质本身具有激活转录的活性, 它们可不经过双杂交相互作用即能激活报道基因的表达。

因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。

例如, Aronheim等人设计了一个Sos蛋白介导的双杂交系统, 也被作者称为Sos救活系统(Sos recruitment system)。

人的鸟苷酸交换因子-Sos蛋白是一种胞质蛋白, 而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25蛋白定位在内膜上, 可将相关受体信号传导给Ras蛋白。

由cdc25突变产生的一种温度敏感突变型细胞不能在36 ℃条件下生长。

但是, 如果Sos蛋白可以通过某种方式被定位到酵母细胞内膜上, 那么它在这种温度敏感突变型细胞中因替代cdc25蛋白的作用, 而使酵母恢复在36 ℃条件下生长的能力。

在Aronheim等人设计的系统中, 待研究的两个蛋白质分别与豆蔻酰基化信号片段和Sos蛋白融合, 前一个融合蛋白定位于膜上, 如果两个待研究蛋白质之间存在相互作用, 这将使Sos也定位到膜上, 从而可激活Ras蛋白使酵母在36 ℃下生长。

利用该技术Aronheim等人找到了c-Jun的两个新的作用伙伴。

此外还有其他类型的双杂交甚至三杂交系统。

酵母双杂交系统
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。

细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。

80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。

而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。

如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。

Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。

他们以与调控SUC2基因有关的
两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。

由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。

如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。

这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。

通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。

这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。

而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。

已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。

结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。

目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。

这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。

其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。

经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。

HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。

大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。

这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。

通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。

其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。

而且, 酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。

因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。

Bendixen等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率。

在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a 接合型和α接合型, 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。

根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, “诱饵”表达载体转化a接合型细胞。

然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。

单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB 融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。

长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。

这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。

针对实际工作中的这种需要, Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入。

URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。

Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。

这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。

在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。

然而如果目的蛋白, 即与DB或AD融合
的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。

通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。

结果得到了体外结合实验的验证。

通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。