绿原酸对脂多糖诱导的急性肾损伤小鼠的保护作用

绿原酸对脂多糖诱导的急性肾损伤小鼠的保护作用
徐静红;毛艳菲
【摘要】目的研究绿原酸(CGA)对脂多糖(LPS)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠的保护作用及其作用机制.方法将50只小鼠随机分成对照组、LPS组、LPS+CGA不同剂量(5,10,20 mg?kg-1)组,每组10只.对照组腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)20 mL?kg-1;LPS组腹腔注射LPS溶液10 mg?kg-1;LPS+CGA各剂量组给予LPS 1 h后腹腔注射0.9％氯化钠溶液配制的CGA溶液.24 h后采集小鼠血液和肾组织,行组织病理学检查,测定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN),并进行肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、蛋白质印迹分析.结果 CGA可呈剂量依赖性地抑制肾组织病理改变、血清BUN和Scr水平,与LPS组比较,均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).CGA能抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1β水平(P<0.05或P<0.01),显著抑制LPS诱导的NF-κB p65磷酸化水平以及TLR4信号表达(P<0.05或P<0.01).结论 CGA能通过调节TLR4/NF-κB信号发挥抗炎作用,保护LPS诱导的AKI小鼠.
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2019(038)007
【总页数】5页(P860-864)
【关键词】绿原酸;肾损伤,急性;TLR4/NF-κB通路
【作者】徐静红;毛艳菲
【作者单位】浙江省丽水市中心医院病区药房,丽水 323000;浙江省丽水市中心医院病区药房,丽水 323000
【正文语种】中文
【中图分类】R286;R965
脓毒症是一种常见、复杂且致命的感染并发症，通常由免疫反应释放大量的炎性细胞因子引起[1]。

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒症的严重并发症，有研究发现其由脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)所致[2]。

脂多糖诱导疾病模型是阐明脓毒症AKI机制和潜在治疗方法的常用动物模型之一。

脂多糖可诱导TLR4信号通路，进而诱导核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化和炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β(transforming gr owth factor-β，TGF-β)和白细胞介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)[3]。

这些炎症细胞因子可能导致肾损伤，使肾小球中性粒细胞浸润和单核细胞转移，特别是肾小球系膜周围区域[4]。

因此，通过抑制炎症细胞因子产生可以有效治疗肾损伤。

据报道，植物多酚对多种炎症性疾病有抗氧化和抗炎作用[5]，其抗氧化和抗自由基性能作用于酶活化、基因表达、信号转导途径，进而阻止或延迟炎症性疾病发生。

已有研究表明，多酚可以分解2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基，清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、羟自由基和超氧自由基，抑制低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，LDL)氧化，螯合铜离子，还原铁离子[6-7]。

绿原酸(chlorogenic acid，CGA)是最常见的多酚之一，具有多重药理活性、强效免疫保护、抗炎、抗菌和抗氧化特性[8]。

此外，有研究发现绿原酸具有预防脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的作用[9]。

研究发现，绿原酸可以减轻链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠的肾损伤。

但绿原酸对脂多糖诱导AKI的保护作用报道较少见。

笔者在
本研究中探讨绿原酸对脂多糖诱导小鼠AKI的治疗作用。

1 材料与方法
1.1 试剂及仪器绿原酸购自中国食品药品检定研究院(批号：110753-201415，含量≥98%)；脂多糖(批号：L-2880)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS，批号：P5368)购自Sigma 公司；血肌酐( serum creatinine，Scr，批号：T17P128B)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN，批号：EIABUN)、TNF-α(批号：168235001)、IL-6(批号：146735017)和IL-1β 酶联免疫吸附测定(ELISA)(批号：147442015)试剂盒均购自eBioscience 公司；增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂购自Milipore公司(批号：WBKLS0100)；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(批号：P0028)、多功能电泳仪(型号：EEP102)购自中国碧云天生物技术有限公司；连续光谱扫描式酶标仪(型号：SpectraMax Plus384)购自美谷分子仪器有限公司。

1.2 动物与处理方法无特定病原体级(SPF)雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购于维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，置于温度(22±2)℃，相对湿度50%～60%，12 h循环照明的环境中适应性饲养7 d，自由摄食和饮水。

采用随机数字表法将50只小鼠随机分成5组，每组10只：对照组、LPS组、LPS+CGA不同剂量(5，10，20 mg·kg-1)组。

LPS组腹腔注射LPS溶液10 mg·kg-1；LPS+CGA组给予LPS1 h后腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的绿原酸溶液。

对照组腹腔注射PBS 20 mL·kg-1。

在LPS刺激后24 h，处死小鼠并采集血液和肾组织。

1.3 组织病理学检查 10%甲醛固定肾组织并切片，石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肾组织病理变化。

采用Jablonski半定量评分标准评价肾损伤程度[10]，0分为正常组织；肾小管损伤面积<5%为1 分；5%～25%为2
分；>25%～75%为3 分；> 75%为4 分。

1.4 Scr和BUN测定按照试剂盒说明书检测Scr和BUN。

1.5 TNF-α、IL-6和IL-1β的测定根据说明书，采用ELISA试剂盒测定小鼠血清
和肾组织TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.6 Western bloting分析使用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取肾脏组织蛋白质。

12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离总蛋白样品(30 μg)，转移到聚偏氟乙烯膜。

室温下5%脱脂乳封闭2 h，将封闭的膜与抗Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)(1：1000)，髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)(1：1000)，核因子
κBp65(nuclear factor kappa-Bp65，NF-κBp65)(1：1000)，磷酸化核因子κB
抑制蛋白(phospho-inhibitor ofNF-κB，p-IκB)(1：1000)，核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)(1：1000)和β-肌动蛋白(β-actin)(1：2000)一抗4 ℃
孵育过夜。

将膜与二次抗体室温孵育1 h，ECL试剂显现免疫反应条带。

1.7 统计学方法采用SPSS 1
2.0版统计软件进行统计分析，所有数据均用3个独
立实验的均值±标准差表示，多组间统计学差异采用方差分析。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 肾组织病理特征见图1。

LPS组肾脏病理损伤明显，肾小管上皮细胞浸润，肾囊腔扩张，管状结构破坏，上皮细胞坏死，坏死细胞进入腔内小管。

与LPS组比较，LPS+CGA 5，10和20 mg·kg-1组肾损伤明显改善(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性。

2.2 Scr与BUN测定结果与对照组比较，LPS组血清Scr和BUN显著升高
(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+CGA各剂量组血清Scr与BUN显著降低
(P<0.05或P<0.01)，见图2。

2.3 TNF-α、IL-6和IL-1β测定结果与对照组比较，LPS组血清和肾脏TNF-α、
IL-6和IL-1β显著增加(P<0.01)。

与LPS组比较，LPS+CGA各剂量组血清和肾
脏TNF-α、IL-6、IL-1β等含量下降(P<0.05或P<0.01)，且该作用呈剂量依赖性(图3)。

2.4 TLR4/NF-κB信号通路测定结果见图4，与对照组比较，LPS组诱导NF-κB
活化和IκB分解，明显增加TLR4和MyD88表达(P<0.05或P<0.01)；与LPS组比较，LPS+CGA各剂量组NF-κB p65和IκB磷酸化显著抑制，且剂量依赖性地
抑制LPS诱导TLR4和MyD88表达(P<0.05或P<0.01)。

A.对照组；
B.LPS组；
C.LPS+CGA 5 mg·kg-1组；
D.LPS+CGA 10 mg·kg-1组；
E.LPS+CGA 20 mg·kg-1组；
F.肾损伤评分；与对照组比较，*1P<0.01；与LPS
组比较，*2P<0.05，*3P<0.01
图1 5组小鼠肾组织病理学特征(HE，×200)
A.control group;
B.LPS group;
C.LPS+CGA 5 mg·kg-1 group;
D.LPS+CGA 10 mg·kg-1 group;
E.LPS+CGA 20 mg·kg-1 group;
F.renal injury score; compared with control group, *1P<0.01; compared with LPS group,
*2P<0.05,*3P<0.01
Fig.1 Pathological features of renal tissue in five groups of mice(HE staining，×200)
A.BUN水平；
B.血肌酐水平；与对照组比较，*1P<0.01；与LPS组比较，
*2P<0.05，*3P<0.01
图2 5组小鼠BUN与Scr测定结果
A.BUN level;
B.serum creatinine level; compared with control group,
*1P<0.01; compared with LPS group, *2P<0.05,*3P<0.01
Fig.2 Determination results of BUN and Scr in five groups of mice
3 讨论
AKI常伴有严重并发症，直接影响其他系统，并导致危重患者多器官功能衰竭[11]。

严重并发症导致AKI患者死亡率达到30% [12]。

因此迫切需要探索新的治疗途径。

绿原酸广泛存在于中草药，具有很强的抗炎作用[13]。

本实验中，与对照组比较，LPS组肾组织病理学及血清生化指标有明显差异，肾小球结构被破坏，肾小管上皮细胞变性，肾小管和肾间质细胞存在严重的细胞内灌流和充血。

此外，LPS组血Scr和BUN水平升高，肾功能不全。

给予不同剂量绿原酸后，小鼠肾组织病理学
变化减轻，血BUN和Scr水平降低。

提示绿原酸可减轻脂多糖诱导的AKI。

脂多糖是导致脓毒症或AKI的关键因素[14]。

据报道，脂多糖所致炎症细胞因子在AKI发病机制中发挥重要作用[15]。

在脂多糖诱导AKI过程中，TNF-α、IL-1β和
IL-6在血清和肾组织升高，脂多糖能诱导AKI发病相关炎症细胞因子产生。

越来
越多的证据表明，抑制上述细胞因子可减轻AKI [16]。

本研究结果表明，绿原酸
呈剂量依赖性地抑制脂多糖诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6产生，抑制这些炎症细
胞因子的释放是绿原酸对脂多糖诱导AKI的保护机制。

为进一步研究绿原酸抑制炎症细胞因子产生的机制，本研究探索了绿原酸对
TLR4/NF-κB信号通路活化的影响，该通路被认为是肾脏炎症主要因素。

脂多糖所致TLR4活化通过诱导炎症细胞因子产生而传导初期损伤，与引发炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达相关的NF-κB信号通路密切相关，已有证据表明减少TLR4和NF-κB介导的炎症反应在各器官中有抵抗AKI的保护作用。

笔者在本实验采用脂多糖诱导小鼠模型，研究绿原酸对AKI的保护机制，结果表
明绿原酸可呈剂量依赖性地抑制磷酸化IκB的表达和NF-κB p65活性。

此外，Western bloting分析研究MyD88和TLR4在肾组织中的表达，发现脂多糖刺激
导致MyD88和TLR4的显著表达，而绿原酸可减弱MyD88和TLR4的活化。

A.血清TNF-α含量；
B.肾脏TNF-α含量；
C.血清IL-1β含量；
D.肾脏IL-1β含量；
E.血清IL-6含量；
F.肾脏IL-6含量；与对照组比较，*1P<0.01；与LPS组比较，*2P<0.05，*3P<0.01
图3 5组小鼠血清和肾脏TNF-α、IL-6、IL-1β含量测定结果
A.serum TNF-α content;
B.renal TNF-α content;
C.serum IL-1β content;
D.renal IL-1β content;
E.serum IL-6 content;
F.renal IL-6 content; compared with control group, *1P<0.01; compared with LPS group,
*2P<0.05,*3P<0.01
Fig.3 Determination results of the serum and renal levels of TNF-α, IL-6
and IL-1β in five groups of mice
实验结果表明，绿原酸可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化来减少脂多糖
诱导AKI的促炎症细胞因子。

与对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与LPS组比较，*3P<0.05，*4P<0.01
图4 5组小鼠TLR4/NF-κB信号通路测定结果
Compared with control group, *1P<0.01，*2P<0.05; compared with LPS group, *3P<0.05,*4P<0.01
Fig.4 Determination results of TLR4/NF-κB signaling pathway in five groups of mice
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