应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)

应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉
工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心
摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。

生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。

我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。

应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。

两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。

蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。

在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。

细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。

蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。

目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。

毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。

生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。

是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。

近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。

这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。

但由于一起条件等限制，国内此方面的报道还不多。

我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。

中性丧失扫描法具有很高的灵敏度，检测限在fmol级。

固相金属亲和色谱〔IMAC〕法是近年来应用最广泛的特异性富集磷酸化肽段的方法，
该方法适用于微量复杂样品的处理。

目前微量IMAC 预装柱ZipTip MC已经商品化，可以方便的与Nanospray微量分析系统相匹配。

这两种方法的建立和成熟运用将为磷酸化蛋白的研究提供便利条件。

一、材料与方法
1．材料
试剂：ZipTip MC，ZipTipμ-C18为millipore公司产品。

磷酸化蛋白β-casein蛋白为sigma 产品，纯度90％。

Trypsin为德国Roche诊断公司经修饰的测序级的酶〔产品编号1418025〕，硝酸鉫〔Ga(NO3)3〕为Aldrich公司产品；实验用水为Milli-Q纯水器制备的超纯水。

色谱纯乙腈为美国Fisher Scientific 产品；a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CCA)为Bruker提供；三氟乙酸(TFA)为Fluka公司产品。

其它试剂均为国产分析纯。

仪器：电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪〔Q-Tof2，Micromass〕，配有masslynx数据系统。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(Autoflex，Bruker)。

2．方法
1)蛋白的溶液酶切：
称取标准磷酸化蛋白β-casein 50μg，溶于50μL 25mM NH4HCO3中。

参加分装保存的胰蛋白酶1 ug，37℃，12h后取出局部稀释成所需浓度备用。

2)离子亲和层析IMAC法富集磷酸化肽段：
①ZipTip MC用0.1％乙酸／50％乙腈／水溶液洗3次，②用200mM Ga(NO3)3溶液洗10次，③用超纯水洗3次，④用1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗3次，⑤0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗5次，⑥蛋白质酶解混合物用酸性溶液〔20％乙酸或1％甲酸水溶液〕调pH至2以下，用ZipTip MC吸取、排出10次以上，⑦ZipTip MC用0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗6次，⑧用超纯水洗3次，⑨2－3μL 0.3N氨水洗脱；
3)质谱分析：
电喷雾质谱仪为英国Micromass公司的电喷雾四极杆正交加速飞行时间串联质谱仪Q-TOF2。

配备毛细管液相色谱和纳升喷雾源。

镀金属钯的硼硅酸盐电喷雾针〔palladiμm-coated borosilicate electrospray needle〕(Protana, Odense, Denmark)是一次性使用的专用needle。

碰撞气体为氩气。

源温80 C，锥孔电压50V左右。

TOF 加速电压为9.1KV。

MCP 检测器电压为2200V。

当进行手动测序时，毛细管电压为800-1200V可得
到稳定的喷雾。

调节碰撞能量和碰撞气体的大小使得到一个好的串联质谱图。

该质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3处理后，用Micromass的专用软件MasSeq直接推倒出肽段序列。

Nanoflow probe进样毛细管电压为3000v。

所有测定均在正离子方式下进行，用Glu-fib(sigma)的串联质谱碎片校正，质量准确度±0.2Da。

中性丧失扫描：设定扫描范围400－2000，扫描方式为中性丧失扫描，寻找中性丧失49的双电荷离子。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪为Bruker公司的Autoflex，将样品溶于0.1%TFA中，取1μL与饱和CCA基质上清液混合，取1µKV；反射电压23KV。

校正用Peptide Calibration Standard(Bruker)。

二、结果与讨论
1、中性丧失扫描：1μL 1μg/μLβ-casein酶解混合物用50％乙腈／水溶液稀释为100μL〔约500fmol/μL〕注射泵进样，正离子中性丧失扫描模式扫描中性丧失49的双电荷离子〔图1〕。

扫描得到一质荷比为1031.50的双电荷峰。

图1：上半局部为中性丧失49扫描的离子流色谱图，下半局部为扫描总离子流色谱图。

图中所示的肽段为扫描得到的磷酸化肽段，与β-casein理论酶切所得到的磷酸化肽段质荷比一致。

〔图2〕FQSEEQQQTEDELQDK其中S为磷酸化的丝氨酸。

该段序列为牛β-casein 前体蛋白的48 – 63位氨基酸序列。

图中上方序列由左至右为肽段的C端到N端。

标记处为磷酸化丝氨酸。

β-casein有5个磷酸化位点，除50位丝氨酸外，30、32、33、34位均有磷酸化，但胰酶酶解后四个位点在一个肽段上，有文献报道磷酸化位点较多的肽段在正离子模式下不易电离，因此我们都没能得到这一肽段的质谱峰。

中性丧失扫描可以高灵敏度准确的定位磷酸化肽段。

但不适于分析在复杂混合物中的相对含量较低的磷酸化肽段。

2. IMAC法选择性富集磷酸化肽段：
用1％甲酸水溶液将样品稀释为不同浓度〔100fmol/μL, 500fmol/μL,2pmol/μL 5pmol/μL〕，各取5μL分别用鉫离子亲和色谱ZipTipMC处理，洗脱后取1μL直接进行MAILD-Tof质谱检测，结果见图3。

结果说明经浓度为2pmol/μL以上的样品ZipTip MC 处理之后的样品中非磷酸化肽段几乎全部被除去，磷酸化肽段信号显著增强；低于此浓度的样品经处理后质谱图中无磷酸化肽信号。

A
B
图3：2pmol/μl胰酶酶解混合物ZipTip MC处理前后的肽指纹谱。

A为处理前；B为处理后，箭头所指为磷酸化肽段
有文献报道不同的金属离子富集磷酸化肽段的选择性和灵敏度不同，我们选择的金属鉫离子是选择性和灵敏度均比拟理想的一种能金属离子，其缺点是比拟昂贵。

另外，研究说明该方法具有一定的局限性：1、磷酸化肽段的损失，一局部磷酸化肽段不能吸附在色谱柱上，另外一局部磷酸化肽段难于洗脱下来。

2、洗脱液可以用氨水或碱性缓冲盐，前者的洗脱效率相对低，但无需脱盐处理，后者的洗脱效率高，但脱盐处理也会损失局部样品。

因此具体研究中还要根据具体要求优化具体实验参数。

综上所述，我们尝试用不同方法对磷酸化蛋白的磷酸化肽段进行分析，定位磷酸化位点。

但不同方法在进行磷酸化分析时各有优点及局限性，在实际应用中应根据样品情况和具体要求选择应用何种方法及具体条件。