专家视角 李金明 我国临床分子诊断试剂发展问题及思考
李金明-临床分子诊断质量保证
实验室仪器设备及管理
加样器：维护、校准 扩增仪：维护、校准 杂交仪：维护、校准 测序仪：维护、校准 芯片扫描仪：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准 离心机：维护 生物安全柜：维护 冰箱：维护
理想的试剂
试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标：
重复性 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限 抗干扰能力
CLIA uses the term “verification”： specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturer’s performance claims when the test is used according to the package insert. （CLIA 性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按 照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产 厂家所宣称的检测性能。）
自建方法和自配试剂
有严格的试剂制备SOP 建立相应的性能指标：重复性、准确性、特异
性、测定下限和抗干扰能力等 应做成一个试剂盒的样子：名称、方法、制备
日期、制备人、有效期等 有使用说明书
实验室质量管理的“灵魂”
标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！
SOP等于试剂盒说明书吗？
源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件） 和实验室实际工作经验积累。 因此高于相关标准文件！！！
[Luminex]）
PCR-Sanger测序
PCR-焦磷酸测序
PCR-新一代测序？
PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等
中国分子诊断行业的发展现状及前景分析
中国分子诊断行业的发展现状及前景分析
在精准医疗如火如荼的当下，分子诊断凭着独特优势，正发挥着越来越重要的作用。
而且生物诊断、免疫诊断市场趋于饱和，分子诊断将成为下一个投资风口，有望迎来高速发展。
随着精准医疗兴起，医疗模式开始朝向为病人量身定制最佳治疗方案的方向转变，个性化诊断和靶向治疗成为发展趋势。
在此背景下，检测手段必须做到快速、精确、特异性强，分子诊断由此走入医学检验界的视野。
分子诊断之因此备受追棒，是因其是精准诊断的核心，而精准诊断是精准医疗的基础。
分子诊断可用于早期疾病的预警、筛查、早诊，重要性可见一斑。
据《中国分子诊断行业分析报告》数据显示，2015 年，全球分子诊断市场规模已近60 亿美元，预计到2020 年将增至93 亿美元，年复合增长率达9.3%。
未来几年内，分子诊断行业都将处于高速成长期。
面对这一钱景，资本开始切入布局。
例如，罗氏制药收购即时护理产品的
不过，作为创新性的技术，分子诊断发展还有很多阻碍。
首先，分子诊断工具成本很高；其次，缺乏熟练的人才处理复杂的平台；最后，监管框架复杂，制约分子诊断进一步发展。
目前，分子诊断主要应用于传染病、肿瘤学、遗传学、血液筛查和微生物学；主要技术包括PCR、芯片、杂交、DNA 测序和新一代测序(NGS)。
随着技术成熟，分子诊断将会应用到更多领域。
我国的分子诊断尚处于起步阶段，但发展势头较好。
特别是国家政府大。
李河民：为诊断试剂发展创新建言
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为诊断试剂发展创新建言
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国 际 首 创 ，被 评 为 １ ８ 年 卫 生 部 科 技 苗 都 源 于 美 国人 之 手 ，而 这 种 成 功 的 ９９
进步 奖一等 奖 ，被 列为全 国十 大科技 根源在于基础工作做 的好 。
从生 物制 品 的发展 史来 看 ，病 原
的 培 养 及 其 有 效 成 分 的 鉴 定 技 术 往 往 是 研 制疫 苗 的 关 键 。 因此 病 原 的 确 定 和 诊 断是 首 要 问 题 ， 是 疫 苗 研 制 的 侦
察 兵 。研 制 疫 苗 需 要 准 确 检 测 保 护 性抗 原 与抗 体 ，例 如 疫 苗 种 子 的 免
务 实的精 神 ，他 在肝 炎疫苗 和诊 断试 结 构 转 型 的 问 题 发 表 自 己 的 看 法 ，希 值 得 探 究 的议 题 。 剂 的 研 究 上 取 得 了重 大 突 破 ，先 后 获 望 这 些 观 点 能 在 我 国 生 物 制 品产 业 的 得 国 家 科 技 进 步 一 等 奖 三 次 ，二 等 奖 科 学 发 展 中得 到 重 视 。 李 老 前 期 也 曾
李金明
技 术 委 员 会 委 员 ，中 国输 血 协 会 专 家 委员 会 成
员 ，中 国 医 院管 理 协 会 临 床 检 验 专 业 管理 委员 会 委 员 ，卫 生 部 临床 检 验 标 准 化 委 员 会 委 员 ， 国家认 可委 标准 物质 ／ 准样 品委员会 委员 ，中 标 南 大学湘 雅 医学 院兼 职教 授等 学术 职务 。 李 金 明研究 员 率 先在 国内开 展 Ｉ 核 酸检 验 的质 量控 制 和标 准 化工 作 ，长 期从 事 临床 分 子诊 断 方法 临床
都 医学 发展科 研基 金课 题 １ ；作 为分课 题负 责人 承担 欧盟第 六框 架计 划 （Ｐ ） 项 Ｆ ６ 国际合 作研 究项 目、科技
重大专项、 “ 十五”攻关 、国家科技基础条件平 台建设项 目等多项课题。主持和主要参与项 目分获 ２０ ０１ 年 、２０ 年和 ２ ０ 年北京市科技奖和中华医学科技奖三等奖。以第一作者 、通讯作者发表论文 １０ ０３ ０８ ０ 余
・
专 家风 采 ・
李金明
李金 明， 《 分子诊 断与治疗杂志 》第 一届
编辑委 员会 副主 编 。
１６ 年 ２ ９３ 月出生。１９ 年毕业于中国协和 ９３
医科大 学 ，获博 士学位 。
中 国 医学 科 学 院北 京 协 和 医 学 院博 士 生 导
师 ，享受 国务 院政府 特殊津贴 。现任卫生部临 床检验 中心临床免疫室主任 ，研究员 ，兼 任国 际临床化学协会 （Ｆ Ｃ） ＩＣ 分子诊断委员会委员 ，
及标准化研究 ，负责全国医院和血站实验室感染性疾病临床免疫学和 Ｐ Ｒ检验 ，以及 自身抗体免疫检验 Ｃ
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化(李金明)
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化李金明国家卫生计生委临床检验中心全国cfDNA检测标准化高峰论坛2016.11.23-24 长沙基因测序技术的发展●1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ）●1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法）●1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）●1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred ）●1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert）●1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等）●2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)●2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。
新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术精准医学不等于高通量测序高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术高通量测序技术的临床应用●染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）●胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation GeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）●肿瘤靶向治疗基因突变检测●单基因遗传病检测●病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序●┈┈高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化●国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室●2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测●2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛●2016年质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测●2017年正式开展：全国肿瘤基因突变高通量测序（组织样本）检测质评计划批准的第一批四个专业的试点单位全面质量管理？●写你所应做的●做你所写的●记录你已做的●分析你已做的以ISO的标准如ISO15189为标志的！标准化？标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。
临床分子诊断质量保证的重要性
作者单位:100730卫生部北京医院卫生部临床检验中心,Email:ljm@ ・述评・临床分子诊断质量保证的重要性李金明 以蛋白质及核酸分子为检测物的临床分子诊断方法主要包括酶免疫试验(EI A)、放射免疫试验(RI A)、荧光免疫测定(FI A)、化学发光免疫测定(CI A)等免疫测定方法及聚合酶链反应(PCR)和核酸杂交(Nucleic acid hybridization)等基因检测方法。
临床分子诊断是临床检验各学科中最具发展潜力的领域,将成为21世纪的主导检验技术。
随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动,临床分子诊断方法将在更深层次揭示疾病的本质,指导临床诊断和治疗。
免疫测定方法是以抗原与抗体间的特异结合反应为基础的检测技术。
理论上只要能得到某种生物或生理活性物质的特异抗体,即可建立这种物质的免疫测定方法。
过去一些难以进行定量检测的微量生物活性物质,如酶、激素、受体、细胞因子等,现已使用免疫测定技术进行临床检测。
随着标记物(同位素、酶、荧光素、微量元素、发光物质等)添加技术的进步,免疫测定技术已从低灵敏的免疫沉淀和免疫凝集反应时代,进入高灵敏的放射免疫、酶免疫、荧光免疫和发光免疫测定时代。
核酸是生命现象的物质基础,细胞因子、受体、酶、激素等是生命活动发挥作用的功能单位。
在核苷酸的细微改变哪怕是单个碱基的变化,都可能引起表达产物的巨大改变,影响生物功能的发挥,进而导致疾病的发生。
基因检测的对象主要是DNA,RNA的检测通常也通过检测逆转录后的互补DNA来实现。
其检测原理主要是核酸扩增和/或利用DNA双螺旋链间互补原理的杂交。
各种核酸扩增和杂交自动化检测仪及核酸提取纯化仪器的不断推出,大大促进了基因诊断技术的临床应用。
除了激素、治疗药物外,很多疾病的特异性标志物是使用分子诊断方法来检测的,如肿瘤标志物、自身抗体、细胞因子、感染性疾病的血清学标志物以及病原体基因、遗传病基因、肿瘤基因、基因突变等,这些标志物的检测质量直接关系到患者的临床诊断和治疗。
2024年分子诊断行业深度研究报告
一、行业概况随着基因技术的不断创新和发展，分子诊断技术已经成为临床诊断的重要手段之一、分子诊断是通过检测和分析患者体内的DNA、RNA、蛋白质等分子信息，以及相关基因突变、染色体异常等来诊断和监测疾病的一种方法。
2024年，分子诊断行业将迎来新一轮的发展机遇和挑战。
二、市场发展态势从市场规模来看，分子诊断行业在中国市场的规模已经达到数百亿元。
而且随着人们对健康意识的提高和医疗技术的进步，市场需求还在不断增加。
另外，政府对医疗器械行业的政策扶持力度也在逐渐加大，为分子诊断行业的发展提供了良好的政策环境和市场机遇。
三、技术创新2024年，分子诊断行业将继续进行技术创新，并不断推出更加精准、快速、高效的诊断技术产品。
例如，基于新一代测序技术的分子诊断产品已经逐渐应用于临床实践中，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供了有力支持。
此外，液体活检等新的诊断技术也将进一步推动分子诊断行业的发展。
四、新兴应用领域分子诊断技术的应用领域也在不断拓展。
2024年，肿瘤分子诊断领域将成为行业发展的重要方向之一、肿瘤分子诊断可以通过检测肿瘤细胞中的特定基因突变等信息，帮助医生判断疾病的类型、分期和预后情况，从而指导治疗方案的选择。
此外，分子诊断技术在遗传病、传染病以及个体化医疗等领域也有着广泛的应用前景。
五、行业竞争格局目前，国内的分子诊断市场存在着较多的竞争者，行业竞争愈发激烈。
主要的竞争者包括国内外知名的医疗器械企业和科技公司，如辉瑞、罗氏等。
这些企业通过技术研发、产品创新以及市场推广等方式来争夺市场份额，同时也加剧了行业内的竞争压力。
六、发展趋势与前景随着医疗器械行业政策的不断完善和市场需求的不断增长，分子诊断行业将继续保持较为快速的发展势头。
未来几年，分子诊断行业将面临更多的机遇和挑战，包括技术创新、市场营销能力的提升以及政策环境的优化等方面。
预计到2025年，分子诊断市场规模有望超过千亿元，成为医疗器械行业中的重要细分领域。
我国临床免疫检验的现状、问题及展望(山东)
Eva Engvall (左一），Peter Perlmann 左三）
Georges Widal
Karl Landsteiner
Rosalyn Yalow
我国临床实验室免疫检验技术的应用
单向免疫扩散试验
免疫电泳试验 免疫凝集试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 透射免疫比浊和散射免疫比浊 全自动化学发光免疫试验
医疗机构临床实验室质量管理办法
ISO15189
？
CAP
全面质量管理的工作循环:PDCA
4个阶段，8个步骤
第一阶段（Plan）有4个步骤： ①分析并找出问题；②找出问题产生的原因；③确 定最主要原因；④制定措施计划。
第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划 第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。 第四阶段（Action）有2个步骤： ①总结、制定标准 （修改质量文件），以巩固提高； ②发现新出现的 问题，转入下一PDCA循环。
我国临床免疫检验及质量 管理的现状、问题及展望
李金明 卫生部临床检验中心
山东省检验医学学术会议 2012.10.18 淄博
免疫测定技术的发展阶段
1896年，肥达试验（Widal test）（免疫凝集试验） 1897年，免疫沉淀试验 1900年，红细胞凝集试验和补体结合试验（Complement fixation test, CFT） 1902年—1970年代：免疫沉淀试验（环状沉淀试验-试管单向免疫扩散 试验-平板单向放射免疫扩散试验-平板法双向免疫扩散试验-免疫电泳 （免疫固定电泳、对流免疫电泳和火箭免疫电泳）-免疫透射比浊、免 疫散射比浊和免疫胶乳增强比浊 1941年— 标记免疫测定技术（荧光抗体技术、放射免疫试验、酶 免疫测定技术、酶联免疫吸附试验、均相(Homogeneous)酶免疫测定 技术、克隆酶供体免疫测定（CEDIA）、化学发光免疫测定技术、纳米 和量子标记技术）。
卫生部临床检验中心李金明教授解读《精准医学与临床实验室规范化》
卫生部临床检验中心李金明教授解读《精准医学与临床实验室规范化》近日，卫生部临床检验中心临床免疫室李金明主任，为大家讲述关于精准医学与临床实验室规范化的相关内容。
近年来，精准医学是一个特别热点的话题，尤其是2015年初奥巴马提出了“精准医学计划”，希望精准医学可以引领一个医学新时代。
而在此之前我们也经常听到一个概念叫“个体化治疗”，请问您认为这两个概念有哪些区别呢？李金明：这个问题其实提的非常好。
其实在我们讲精准医学之前，有一个概念叫个体化医学，英文叫“Personalized Medicine”，精准医学叫“Precision medicine”。
其实，这两个概念是一脉相承的，并且这两个概念在内容上是完全一致的。
在2008年美国总统科学与技术顾问委员会对“Personalized Medicine”这个概念有一个专门的定义，其核心含义是根据病人的遗传背景，也就是基因检测把病人分为两类。
分类是为了药物治疗，一类可以用这个药物，而另一类不适合这个药物，减少药物副作用（安全性），节省医疗资源（经济性）。
其实在2015年1月美国总统奥巴马提出了“Precision medicine”这个概念之前的5-6年，很多杂志上已经出现过这个概念。
这个概念的核心含义是根据患者的遗传背景、生活方式、环境因素等来量体裁衣的对患者用药，也是保证有效性、安全性和经济性。
所以“Precision medicine” 和“Personalized Medicine” 这两个概念是一脉相承的。
那么为什么后来欧美的学者要推动用“Precision medicine”替代“Personalized Medicine”，一个核心的原因就是怕民众造成误解。
因为“Personalized Medicine”的前身叫“Individual medicine”，说容易让民众理解为会为每一个人准备一种药物。
那么其实不是的，是把病人分类。
用“精准医学”能够更好的阐述，不容易造成误解，这是最主要的原因。
临床分子诊断的质量管理及展望
卫生部临床检验中心李金明写在课前的话临床分子诊断从发现DNA双螺旋结构到人类基因组计划的基本完成，经历了50余年的发展历程，而我国临床分子诊断质量管理与之相应，也出现了一些问题，更得到了发展。
为提高对临床分子诊断的认识，本课件从临床分子诊断的发展历程、我国的质量管理、临床基因扩增检验的优越性及临床分子诊断实验存在的问题，以及对未来的展望进行详细阐述，旨在促进对临床分子诊断有更加深入的认识。
一、临床分子诊断的发展历程如果从1953年沃森和克里克发现DNA双股螺旋算起，到2003年，临床分子诊断就经历了50年的发展历程。
在这段历史里，有一些重要的里程碑：（1） 1953 年 : 沃森和克里克发现 DNA 双股螺旋；（ 2 ） 1963 年，发现了放射免疫测定技术、核酸测序方法，开创了免疫测定技术的新时代。
通过使用同类素、放射性核素来进行标记，大大提高了免疫测定的敏感性，使低浓度蛋白的检测成为可能。
（3） 1972 ～ 1973 年，有了重组 DNA 技术。
重组 DNA 技术在分子诊断领域里无疑具有非常重要的地位，并对我们现代的日常生活有着非常重要的影响，如彩色的棉花、转基因的食物都利用了重组 DNA 技术。
（4） 1983 年，出现了 PCR 测定技术。
这是分子诊断领域，甚至生命科学研究领域的一项革命性的技术。
（5） 1991 ～ 1993 年，发明了实时荧光 PCR 技术和芯片技术。
芯片技术的出现使高通量的检测成为可能，实时荧光 PCR 技术在分子诊断领域，尤其是边缘体的核酸的检测应用非常广泛。
（6）2003年，人类基因组计划基本完成。
人类基因组计划是从1990年开始实施的，当时由于 DNA 聚合酶的发现以及 PCR 仪的研制成功使 PCR 技术常规应用的瓶颈问题全部迎刃而解，因此启动了人类基因组计划。
此外，还有纳米的和量子的标记技术。
作为临床分子诊断最初发展的DNA双股螺旋是于（）年发现的。
A. 1953B. 1963C. 1973D. 1983A. 1953B. 1963C. 1973D. 1983临床分子诊断的发展历程里有哪些重要的里程碑？我国的临床分子诊断的发展中出现过哪些问题？临床基因扩增检验的优越性和局限性各是什么？关于PCR实验室的分区设计表述错误的是（）。
临床分子诊断应用的发展和趋势ppt课件
在亲子鉴定中的应用
DNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。 如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA
探针上不吻合,那么被测试男子便被100%排除,即他是 亲生父亲的可能性是0%。反之，如果孩子和被测试 父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定 其为亲生父亲，只能计算出99.95%或更大的概率。 事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父 的情况，但这种情况的可能性极低。
在个体鉴别中的应用
基因指纹又称DNA指纹，指的单基因座探针限制性片 段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗传密码 字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30 亿个这种字母，它们在人体每个细胞的染色体上都以 一定的次序排列，排列次序的不同使得一个个体与另 一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基 因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反，遗传上相 关的个体（如同胞、父子）相应地在其字母序列上有 很大的相似性。
亲子鉴定的手段主要有两大类: (1)血液中各种抗原成 分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、 红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型；（2）DNA 多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长 度多态性（DNA指纹）和单基因座扩增片段长度多态 性（包括用多聚酶链反应(PCR) 检测的可变数目串联 重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR)）。
后基因组时代--基因组学
结构基因组学 结构基因组学，是由结构生物学与功能基因组 学紧密结合所产生的，其科学目标就是要规模 化地测PCR检验的国内外现状
国外以前应用相对较少,主要为 ROCHE的COBAS AMPLICOR
国内从2002年开始规范化应用,以实 时荧光PCR为主
1990 Human Genome Project
我国临床分子诊断试剂发展：问题及思考
我国临床分子诊断试剂发展：问题及思考
李金明
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2014(000)003
【摘要】我国的临床分子诊断试剂经历了分子杂交、聚合酶链反应（PCR）-琼脂糖凝胶电泳、PCR-酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时荧光PCR等发展历程，对操作简单化的追求，影响了试剂的重复性和敏感性。
个体化医学检测的发展，使得依赖于不同检测平台的分子诊断试剂正在不断出现，如PCR-Luminex、PCR-测序和高分辨熔点曲线分析等。
目前及今后相当长一段时间内，我国的临床分子诊断操作仍将以手工操作为主，并且应有自配试剂。
如何开发适用于基层医疗机构临床实验室的分子诊断试剂是值得去思考的一个问题，检测的自动化无疑是一个发展方向。
【总页数】3页(P199-201)
【作者】李金明
【作者单位】卫生部北京医院卫生部临床检验中心，北京 100730
【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
1.一本研究我国现阶段知识分子问题的学术力作——《时代的中坚一我国现阶段的知识分子问题研究》书评 [J], 要兴磊
2.研究我国现阶段知识分子问题的学术力作——《时代的中坚——我国现阶段的知识分子问题研究》评介 [J], 齐卫平
3.我国现阶段知识分子问题研究的创新成果——《时代的中坚——我国现阶段的知识分子问题研究》评介 [J], 毕宪顺
4.我国高分子学科发展的趋势、问题与对策--“高分子科学发展战略研讨会”会议纪要 [J],
5.我国临床诊断试剂发展迅速 [J], 李建华
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荧光定量PCR技术(李金明)
1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广 泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血 液筛查
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火
PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸
第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列
高浓度/高效率 高浓度/低效率 低浓度/高效率
N
N n
:扩增分子的数 目 :扩增循环的次 数
n
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指
数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为 PCR扩增的平台期。
定量PCR的方法
定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、 动力学方法和内标共扩增方法 定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数 量）和相对定量（即测定不同样本中X的比 率）
速率，最终达到平台，不再扩增.
影响PCR扩增效率的因素: PCR定 量的困难?
引物/靶的杂交 反应试剂的相对量 样本在扩增仪中的位臵的不同 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在 PCR扩增模板的量 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低
PCR 和定量问题
log-phase analysis end-point analysis
X(原始模板数)的计算
一旦效率确定后，根据公式（4）可从测
定的产物量和循环周期数计算得到X。公式
（4）来源于公式（2）的重新排列：
X＝Yn /(1＋E)n （4）
X的另一种计算方式(1)
另一种方式是，根据公式（2）的对数形 式，以所测定的Yn值的对数对函数n绘图得 到X值： logYn = logX + n×log(1+E) (5) 当n＝0时，可在图上读出X值，或通过对 公式（5）的线性回归计算X值（图2）。
精准“分”晓“质”证疑难浅析分子诊断的质量管理与性能验证
精准“分”晓“质”证疑难浅析分子诊断的质量管理与性能验证文章整理自国家卫健委临床检验中心李金明教授的专题讲座自1953年Watson与Crick发现DNA双螺旋结构以来，一系列分子生物学新技术相继出现，如:Sanger测序、放射性核素和非放射性核素标记技术、电泳、层析、核酸纯化、核酸液相和固相杂交、基因工程技术、限制性酶切、毛细管电泳、PCR、基因芯片、质谱、新一代测序等。
这些技术为临床分子诊断发展,提供了源源不断的动力和无限的想象空间，并在应用中不断成熟，使得分子诊断技术成为检验医学中最具活力一个的领域。
随着分子诊断技术的快速发展，其在诸多疾病诊疗中也正发挥着越来越重要的作用，逐步迈入个体化医学时代。
目前，临床分子诊断相关的方法流程中几乎都存在基因扩增环节，尽管相关主管部门从2002年开始就对临床基因扩增检验实验室进行规范化管理，提出质量保证要求，但仍存在SOP可操作性差、仪器维护校准不到位、室内质控开展过程的形式化等质量问题。
分子诊断的质量管理核心及方法检验医学为疾病的诊断、治疗、康复和预防提供实验室依据，临床检验质量对于检验医学的重要性不言而喻。
那么，分子诊断的质量管如何从“难”变“易”？现阶段，临床分子诊断具备快、多、广、高四大特点。
“快”意为“发展快”，从单个基因或单个DNA、RNA分子检测的1.0时代，现在已发展到多基因检测的2.0时代、多组学分析（基因组、转录组、蛋白质组等）的3.0时代；“多”意为“方法多”，包括了荧光PCR、PCR-杂交法、PCR-测序、PCR-SSCP、质谱、微流控芯片等；“广”意为“应用广”，分子诊断目前已经应用与病原微生物、药物基因组学、肿瘤靶向和免疫治疗、产前筛查和诊断、遗传病、罕见病等领域；“高”意为“要求高”，技术的快速发展，自然对人员、质量管理、实验室环境及仪器设备等均提出了更高要求。
质量管理的本质即为过程的管理。
通常将过程控制划分为分析前质量控制（申请单、患者准备、采血标本、标本存放和运送等）、分析中质量控制（标本测定、结果计算等）、分析后质量控制（检验结果的发出至临床应用）。
分子病理诊断的现状与思考
分子病理诊断的现状与思考摘要：基于总体视角，我国分子病理诊断发展进程相比于国外大体上同步，我国国内最早的分子病理针对为上个世纪八十年代的DNA原位杂交，之后随着更多与肿瘤有关的基因被发现，也诞生了更多的检测和抑制癌基因的分子病理技术。
鉴于此，文章详细阐述了分子病理诊断的现状及思考，希望能够为行业发展提供帮助。
关键词：分子病理；诊断；现状；思考前言：分子病理诊断，具体为经过应用分子生物学技术，基于基因水平视角，判断及检测细胞与组织分子遗传学的变化，它是一种病理诊断技术，在病理诊断、靶向治疗、疗效预测和预后预测等方面都有很大的帮助，其也为转化医学范畴一类。
基于本质而言，广义上可把分子病理诊断定义成以组织与细胞分子水平为基础的疾病诊断，狭义上讲，它为一细胞或组织基因水平为基础的一种病理诊断，其可叫做分子病理诊断。
1我国分子病理诊断的发展现状概述总体而言，现今，可以说我国分子病理诊断发展进程和国外大体同步。
我国最早的分子病理诊断就是上世纪80年代的DNA原位杂交，在社会不断发展进步下，发现了更多的与肿瘤有关的基因，则不断诞生了更多的检测和抑制癌基因的分子病理学技术。
本世纪初，肿瘤靶向药物的使用导致了靶向诊断的诞生，乳腺癌HER2基因扩增的FISH检测和肺癌中EGFR基因突变的ARMS检测都是我们较为熟悉的新技术。
最近一些年，已经有更多的医院在应用分子病理诊断，所以，可以说，最近一些年，我国分子病理诊断处于蓬勃发展时期，然而，虽然我国分子病理诊断同国际趋势大体相同，当通过对比，我们在认识度及普及方面还有规范化程度上的距离还很大。
精准医疗环境下基层医院病理科分子病理学发展面临着巨大的挑战，病理学界应当充分重视这一现实。
由于历史、工作环境等诸多原因，我国病理从业人员数量少，分布严重不均。
主要存在的问题如下：①医院病理科条件差，病例数量少，不具备开展分子病理检测的条件。
②病理科医师和技术人员对分子病理学认识不足，对其检测的临床意义、检测方法及标本规范化处理等方面缺乏必要的知识。
2024年分子诊断试剂行业分析报告
一、行业概况分子诊断试剂行业是指通过检测分子水平的生物标记物，用来诊断疾病、评估治疗效果、预测疾病进展等的一类产品。
近年来，随着技术的不断进步和人们对个体化医疗的需求增加，分子诊断试剂行业得到了快速发展。
2024年，全球分子诊断试剂市场规模达到XX亿美元。
二、市场规模及趋势1.市场规模：2024年，全球分子诊断试剂市场规模达到XX亿美元，同比增长XX%。
其中，北美地区占据市场份额的XX%，欧洲地区占据市场份额的XX%。
2.市场增长趋势：分子诊断试剂市场增长受益于技术的不断进步和医疗水平的提高。
近年来，分子诊断试剂在癌症、遗传病、感染病等领域的应用不断扩大，推动了市场的增长。
预计未来几年，市场规模将继续保持较高增长率。
三、技术发展趋势1.下一代测序技术（NGS）的发展：NGS技术的出现可以大幅度降低测序成本，提高测序速度，为后续分析提供更多的数据。
由于其在个体化医疗、基因突变检测等领域的应用潜力巨大，预计未来几年NGS技术将逐渐取代传统测序技术成为主流。
2.液相芯片技术的发展：液相芯片技术可同时检测多种生物标记物，具有高通量、高灵敏度、高特异性等优势。
随着技术的不断发展，液相芯片技术将逐渐成为分子诊断试剂行业的重要技术手段。
四、市场竞争格局1.主要市场参与者：全球分子诊断试剂市场竞争激烈，主要参与者包括罗氏诊断、霍夫曼-拉罗奇等国际大型医疗器械公司，以及部分中国公司如博奥生物、医仕堂等。
2.市场份额分布：目前，国际大型医疗器械公司占据了全球分子诊断试剂市场的主导地位，其品牌影响力和技术优势使其具备较大的市场份额。
中国公司在国内市场上表现良好，但在国际市场上的竞争力仍较弱。
五、未来展望1.技术创新：随着技术的不断进步，分子诊断试剂行业将迎来更多的技术创新。
新一代技术的应用将进一步提高产品的敏感性、准确性和可操作性。
2.市场拓展：随着个体化医疗的提出和人们对健康的重视，分子诊断试剂的市场需求将不断增加。
精准医学焦点问题透视
84SPECIAL REPORT 特别报道精准医学焦点问题透视Perspective on the Focus Problem of Precision Medicine本刊记者/李亚红 肖思思 王琳琳 熊争艳 李江涛 王敏通过基因检测等技术找“准”病因，给病人找到最适合的药品和疗法，从而节约费用，提升疗效——精准医学，正将医疗健康事业带入一个全新的时代。
然而记者近日在调研时发现，我国要真正迈入精准医学时代，还需要越过三道坎。
检测不准就谈不上精准精准医学的最关键一步：精准评估风险、精准诊断病情。
“病人已经显露出的症状如同水面上的冰山，据此要认识整个冰山，往往难于精准，必须充分运用基因组、分子影像等各种技术。
”中国工程院院士、北大医学部主任詹启敏说，精准医学包括对健康风险的精确预测、对疾病的精确诊断和分类、对药物的精确应用、对疗效的精确评估、对预后的精确预测等。
“没有精准检测，哪里有精准医疗？”国家卫计委临床检验中心副主任李金明说，“目前，我国做基因检测的独立医学检验所已超过200家，相当一部分实验室所做的检测结果存在准确性问题。
一些三甲医院临床实验室的基因检测水平也不尽如人意。
”美国发布精准医学计划的目的之一是有效防控癌症。
当前，我国精准医学应用最多的也是在癌症治疗领域。
然而，2015年12月底，国家卫计委临上海正大基因科学研究院的技术人员在搜集受检者的口腔黏膜脱落细胞，以便后期进行基因分析85床检验中心发布2015全国肿瘤诊断与治疗高通量测序室间评估报告：对我国72家医疗机构临床实验室的肿瘤基因突变高通量测序检测进行评估，实验室检测的基因数从4个至377个不等。
100%正确的实验室仅占总实验室数的16.7%，22.2%的实验室成绩为零分，检测结果准确性存在较大问题。
精准医学检测实验室为保证检测质量，应该集中设置，统一管理，但记者采访发现，我国的精准医学检测，除检验科外，大部分分布在病理科、妇产科、药剂科、肿瘤科、放疗科、胸外科、呼吸科、心血管科等多科室。
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[专家视角] 李金明：我国临床分子诊断试剂发展:问题及思考
一、历史
我国的临床分子诊断试剂的出现,最早可以回溯到上世纪80年代,较国外晚10年左右,当时国外主要用于遗传病的诊断,我国则主要用于乙型肝炎等传染病的检测,这与我国人群乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染率高,乙型肝炎患者较多是分不开的。
那时,主要是采用硝酸纤维素膜上斑点杂交方法,探针采用32P标记,杂交完成后,通过放射自显影显示结果,后来,逐步发展到采用生物素或地高辛等非同位素标记。
上世纪90年代以前,在我国涉及乙型肝炎治疗的医院临床实验室应用核酸斑点杂交检测HBV DNA相当普遍。
斑点杂交技术的特点是简单方便,但检测敏感性低,今天看来,将其用于对检测灵敏度要求较高的病原体的检测并不合适。
1983年,美国Cetus公司的Mullis发明了PCR技术,其利用DNA高温变性和低温复性的基本原理,通过变性、复性和延伸3个温度变化,成功实现了DNA在体外的复制。
但该技术最初由于每一扩增循环均需加入DNA聚合酶(因其不耐热),实际应用受到限制,成为PCR应用于疾病诊断的瓶颈,随后几年,该公司成功从美国黄石国家公园温泉中分离到的嗜热菌中得到了耐热的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶),1989年被美国Science杂志命名第一个“年度分子”使PCR临床应用的瓶颈问题迎刃而解,从而使得PCR成为临床分子诊断和生命科学研究中的一个革命性技术,预示着分子时代的到来。
因此到90年代初期,国内一批研究人员迅即将这一技术用于HBV的临床检测,出现一大批生产PCR试剂的公司,采用的基本技术是PCR-琼脂糖凝胶电泳方法,靶核酸经PCR扩增后,会出现一定长度片段的特异扩增产物,电泳分离后,经溴化乙啶染色,紫外线下可见相应的分子大小的条带。
到90年代中期,又有一些厂家,生产了PCR-板上杂交即PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。
但由于PCR-琼脂糖凝胶电泳和PCR-ELISA均为PCR后有一个开管取扩增产物进行分析的过程,极容易出现扩增产物被“污染”所致的假阳性结果,临床反映强烈,直接导至1998年4月卫生部下文暂停了PCR检验在临床中的应用。
其实在90年代中期,国内一些企业已意识到这种假阳性带来的问题,开始研发实时荧光PCR 检测试剂,并用于临床检测。
二、现状及问题
临床检验的发展方向无疑是自动化,临床分子诊断亦是如此。
自动化带来了“检测系统”的概念,即检测仪器、试剂和校准品的一体化,从而避免了同一试剂在不同实验室配不同仪器所带来的结果不确定的问题,但由于我国整体工业水平(尤其是原材料工业和精密加工工业)与西方发达国家的差距,在国产仪器设备的基础实现临床检验的自动化尚需时日,临床分子诊断尤甚。
因此,目前我国的临床分子诊断在核酸提取、扩增反应液准备、扩增前加样、上机、产物分析和结果分析报告等方面仍是以手工操作为主。
分子诊断中繁杂且要求精细的手工操作步骤,使得临床实验室工作人员总在不断追求操作步骤简单的试剂,试剂生产厂家为满足用户的这种需求,也在努力追求操作简单化,于是一些只需要简单核酸提取或不需核酸提取、最少试剂配制的检测试剂应时而生。
如目前在国内广泛使用的HBV DNA实时荧光PCR试剂。
任何一件产品,如果生产过程只是追求简单,则一定会以质量下降为代价。
因此,国内的用于传染病检测的PCR试剂如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)和人类免疫缺陷病毒-1 RNA(HIV-1 RNA)定量检测,与国外同类试剂盒相比较,一直存在重复性、分析敏感性和抗干扰(溶血、黄疸、脂血等)能力差等问题[1,2,3]。
存在这些
问题的最根本原因主要在于核酸提取,荧光PCR扩增阶段的试剂水平与国外并无太大差距。
临床标本中可能存在血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、胆红素、血脂等均是PCR扩增反应的抑制剂,是否能有效地将这些抑制物从标本中去除,决定了后续的PCR扩增效率。
核酸提取方法过于简单,则无法将这些抑制物有效去除,直接影响后面的扩增检测结果,影响上述检测性能。
而且,也因为这些抑制物的存在,无法在扩增检测时加大样本加入量。
样本加入量小,一是加样的重复性和准确性都相对较差,最后会反映在整个检测的重复性差;二是直接影响分析敏感性。
作为PCR扩增来说,从理论上讲,每个反应管内至少有1个分子,才会出现扩增,加样量少,在标本内相应靶核酸含量少的情况下,则取得1个以上靶分子的可能性也小,反之越大。
相对于传染性病原体核酸检测来说,人的基因检测试剂在上述方面问题相对较少,因为人的基因含量高,一般不存在因标本中基因组含量少而影响检测敏感性的问题,通常的核酸提取方法均可达到相应要求。
近年来,随着药物基因组学和肿瘤靶向治疗等的研究进展,与个体化治疗用药相关的基因多态性、基因突变和基因量的变化等的检测正迅速走向临床应用。
国内众多厂家正在采用各种方法开发商品试剂,如基于实时荧光PCR的方法、PCR-杂交(硝酸纤维素膜、乳胶颗粒如Luminex、玻片如基因芯片等)、PCR-测序(双脱氧测序、焦磷酸测序、新一代测序如Illumina、Ion torrent等)和PCR-高分辨熔点曲线分析(HRM)等,技术多种多样,各有特点,有的对实验室分区和操作人员的要求较高,对广大基层实验室来说,较难实际应用。
因此,作为临床实验室如何判断一种试剂方法能否有效地用于日常检测,最重要的是在自己实验室条件,对相应的试剂方法进行性能验证,主要的性能指标有重复性、准确性、特异性、检测限和抗干扰能力等,这些性能指标中最重要的是重复性,其是准确性的前提。
评价重复性的1个简单方法是,选择不同强弱阳性及阴性的数份样本进行20次批内和批间测定,看是否能得到相同的结果。
如否,需寻找原因,排除实验室环境条件及人员操作的因素,如果确认属于试剂或方法的问题,则该试剂或方法就不具备临床实用性,不能用于临床检测。
三、展望
随着对人类基因及其结构改变、基因表达或表达产物代谢异常与疾病的发生、发展和药物作用上的研究进展,分子诊断不只是涉及DNA和RNA,也涉及蛋白组学和代谢组学检测。
检测方法学的进步,使得因疾病而改变的基因及其结构改变的谱、基因表达谱(RNA和蛋白谱)、代谢通路上的小分子谱的检测变得容易,将出现一大批可用于临床疾病诊治的分子诊断标志物,使人类对疾病的认识,由点入面,最后得到1个清晰的全景图像,治疗成为有的放矢,使得患者疾病的治疗进入到真正的个体化时代。
由上述可见,实验室检测尤其是分子诊断的准确性对于个体化医学时代患者疾病的诊治的重要意义。
1.方法学的更新换代
尽管在国内外文献上发表的分子诊断方法很多,并且还在不断出现,也有不少人尝试将用于临床诊断,但随着时间的推移,一些在临床实际检测中证明重复性不好的只适用于科研的方法,将会被完全淘汰。
有些方法,在对操作者有严格训练的情况下,可得到好的重复性,但很难广为
推广应用,只适用于个别实验室自配试剂使用。
适用于广大基层临床实验室的检测方法,通常应具备以下特征:(1)对实验室的分区要求低;(2)对人员的操作的精确度要求不高;(3)结果分析简单。
2.商品试剂与实验室自配试剂
我国的临床检验由完全的自配试剂进行日常检测进入到依赖商品试剂盒,是从上世纪80年代末开始的,到90年代中后期,实验室基本不再使用自配试剂。
分子诊断不同于临检、生化、一般免疫分析等,其日常检测量明显较少,且一些特定的检测项目如遗传病和罕见疾病的分子诊断,病例数更少,这些疾病的分子诊断试剂是永远也不可能有经过批准的商品试剂盒的,因此,就必须允许临床实验室自配试剂进行检测。
最重要的是,如果是自配试剂必须有自配试剂的标准操作程序(SOP),包括从原材料选择及其每批质检、试剂配制、试剂的性能验证(重复性、准确性、特异性、检测下限、抗干扰能力等)、每批试剂质检方法等,最后形成的应是一个非商品试剂盒,从内到外应有商品试剂盒所具备的所有必要成分,并标明有效期。
实验室应保存该试剂制备的所有原材料购置、质检和制备的实验记录。
用于日常检测时,应有严格的室内质量控制,如有室间质量评价,则应参加,如无,则应有实验室间比对,以保证日常检验的质量。
3.实验室检测的自动化
随着我国基础工业的进步及下游工业的全球化,临床分子诊断的自动化将逐步在国内的临床实验室应用。
自动化首先将是在目前手工操作且对结果影响最大的核酸提取上实现,然后是结果的分析判断,这方面软件将起到最为关键的作用。
当然最终目标,是实现从核酸提取到扩增检测、结果报告全过程的自动化,国外一些厂家如罗氏、凯杰已实现了这一点,但对于国内企业来说,仍需要一个相当长的时间。
来源：检验医学杂志。