生物化学检验技术研究进展新

• 应用：
高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量
离心技术
• 原理：离心是利用旋转运动的离心力 以及物质的沉降系数或浮力密度的差 异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 颗粒的沉降速度取决于离心机的转速 及其自身与中心轴的距离。不同大小、 形状和密度的颗粒会以不同的速度沉 降。
电化学分析技术
• 定义：利用物质的电化学性质，测定 化学电池的电位、电流或电量的变化 进行分析的方法称为电化学分析法。 • 原理：将电极浸入待测溶液中组成原 电池，其中一支电极的电极电位与待 测离子的活度有关，此电极为指示电 极；另一支电极是电位已知并且恒定 的所谓参比电极，目前最常用的参比 电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
分光光度法
• 原理：利用紫外光、可见光、红外光和激光 等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对 物质进行定性定量分析和物质结构分析的方 法，称为分光光度法或分光光度技术，使用 的仪器称为分光光度计 。 • 应用：氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测 定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子 的鉴定和酶催化反应动力学的研究
天津医科大学 检验系
生物化学检验技术研究进展
赵晓君
主要内容
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生化检验的发展简史
生化检验的常规技术 生化检验的新兴技术 生化技术的临床应用
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概念
临床生物化学是研究器官、组织人 体体液的化学组成和进行着的生物 化学过程，以及疾病、药物对这些 过程的影响，为疾病诊断、病情监 测、药物疗效、预后判断和疾病预 防等各个方面提供信息和理论依据。
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待纯化分子
基质
纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基质
应用
分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
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+
研究酶的结构与功能
杂质
d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
+
聚焦层析（Chromatofocusing）
生化检验的常规技术
一、光谱分析技术 二、电泳技术 三、离心技术 四、层析技术 五、电化学分析技术
光谱分析技术
定义：利用各种化学物质(包括原子、 基团、分子及高分子化合物)所具有的 发射、吸收或散射光谱系的特征，来 确定其性质、结构或含量的技术，称 为光谱分析技术。根据物质对光谱响 应特征的不同，可把光谱分析技术分 为发射光谱分析技术、吸收光谱分析 技术和散射光谱分析技术三大类。它 既可以研究物质的结构，也可以对特 定物质进行定性或定量分析。
电泳技术分类（按实验装置分类）
纸电泳
薄膜电泳
垂直板凝胶电泳
凝胶电泳
毛细管电泳
毛细管电泳
常用电泳技术
一、醋酸纤维薄膜电泳 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 1、SDS-PAGE 2、PAGE等电点聚焦 三、琼脂糖电泳 四、毛细管电泳
SDS--PAGE
• 原理： 当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate,十二 烷基硫酸钠）与蛋白质结合后，蛋白质分子 即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来 的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差 别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在 SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致， 所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的 泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此 条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的 迁移率呈直线关系。 • 应用: 测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数
概念临床生物化学是研究器官组织人体体液的化学组成和迚行着的生物化学过程以及疾病药物对这些过程的影响为疾病诊断病情监测药物疗效预后判断和疾病预防等各个方面提供信息和理论依临床生物化学19世纪以来随着医学科学的収展和实验室检测需求的增加一些化学家利用化学分析的手段实现了对人类体液血液某些生化指标的定量分析如血糖尿素氮等继之又逐渐建立了一些酶活性的测定方法这些利用化学手段建立的用于分析患者体液血液特定化学成分的方法对促迚临床医学由经验医学向现代医学转变起了巨大的促迚作用逐渐形成了一门独立的学科临床化学clinicalchemistry国内习惯称此学科为生化检验
鉴于临床的需要，国外一些公司设计 了自动高效液相色谱仪，具有以下优 点：①固定色谱柱和流动相，使一台 仪器适合多种药物的检测。②利用计 算机技术，储存几百种药物的图谱， 能自动识别未知药物。③为提高图谱 鉴别能力，该机利用了三维光谱、出 峰时间等多种手段。④自动进样系统 使仪器自动定量或定性测定，分析多 达50个样品。
与普通电泳比较
CE和普通电泳相比, 由于其采用高电 场, 因此分离速度要快得多；检测器 则除了未能和原子吸收及红外光谱连 接以外, 其它类型检测器均已和CE实 现了连接检测；一般电泳定量精度差, 而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度 比普通电泳要高得多。
优点
• 三高二少：
• 高灵敏度：常用紫外检测器的检测限可达10-13～ 10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol； • 高分辨率：其每米理论塔板数为几十万；高者可 达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万； • 高速度： 最快可在60s内完成, 在250s内分离10 种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离 30种阴离子； • 样品少：只需nl (10-9L)级的进样量； • 成本低：只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的 毛细管。
毛细管电泳装置示意图
毛细管 光源
数据采集 光电倍 增管
缓冲液-样品 高压电源
缓冲液
发展历史
• 1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在 75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。 • 1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力 学色谱。 • 1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。 • 1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商 品仪器。
该法分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质 按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成 (由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白 质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅 速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的 速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中， 一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚 焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。
典型的高效液相色谱仪包括输液系统、 进样分离系统、检测系统和数据处理 系统等部分。流动相用一高压泵输入， 输入前要先脱气。在分离过程中按一 定程序连续改变流动相的离子强度、 pH和极性，以改变分离条件、提高分 离效果、缩短分离时间。进样可以是 注射器进样，也可以是进样阀进样。 HPLC使用的检测器应用最多的是紫外 或紫外-可见分光检测器，还有荧光检 测器、电化学检测器等。
流速 移动速率
蛋白质1（pI=7） 蛋白质2（pI=8）
pH梯度溶液的形成示意图
层析时的聚焦效应示意图
电泳技术
原理：电泳是带电颗粒在电场作用下向着 与其电荷相反的电极移动的现象 。许多生 物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于 分子组成、性质及其所在介质的pH。如果 混合物中各组分的结构组成不同，在某一 pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数 量不同，加之其分子量不同，在同一电场 的作用下，各组分泳动的方向和速度也各 异，而达到分离鉴定各组分的目的。
毛细管电泳
毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是
在毛细管（ 2-75μm）中装入缓冲液，从其
一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电
实现对样品的分离，分离后的样品依次通过
设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了
传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题， 实现了快速和高效分离。
原理：CE所用的石英毛细管柱, 在pH>3情 况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形 成了一双电层。在高电压作用下, 双电层 中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方 向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电 解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF) 两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和 电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电 泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于 电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流 方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电 泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
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3、4. 解吸附阶段：用 梯度缓冲溶液洗脱，先 洗下弱吸附物质，后洗 下强吸附物质 5.再生阶段：用原始平 衡液进行充分洗涤，既 可重复使用
原始缓冲溶 液的反离子 样品溶液 梯度浓度
亲和层析（affiuity chromatography）
原理：
a.待纯化分子和配体间具有亲和性
配体
分类
吸附层析 分配层析 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
离子交换层析（ion-change chromatography）
原理 基质 应用
1.平衡阶段:离子交换 剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品与反
离子进行交换
疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
等电点聚焦
• 原理：在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两 性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧 基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和 pI值各自相异却又相近），当直流电通过时， 便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。 两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其 等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按 其各自等电点得到分离。
层析技术
原理：层析技术是一种物理的分离方法。无 论何种层析，其系统通常由互不相溶的两 个相组成：一是固定相（固体或吸附在固 体上的液体），一是流动相（液体或气 体）。层析时，利用混合物中各组分理化 性质（如吸附力、分子形状和大小、分子 极性、分子亲和力、溶解度等）的差异， 使各组分不同程度地分布在两相中，随着 流动相从固定相上流过，不同组分以不同 速度移动而最终被分离。
临床应用
高效液相色谱法是目前最好的血药浓度监 测方法，但在实际应用中还存在一些问题， 如每遇到一种新药必须摸索测定的最佳条 件；各种药物的测定条件不同，要不断的 更换流动相甚至色谱柱；每次只能测定一 种药物，至多只能测定一类药物，无法测 定性质不同的药物。因此，高效液相色谱 法用于常规血药浓度监测，只适用于少量 常用的某些特定药物，大大限制了它的推 广应用。
临床生物化学发展的重大突破
• “临床化学”名称的由来 • 体液生物化学组分的分析应用及“细胞内环境相 对稳定”概念 • 比色法和光度法在临床生物化学实验室中的应用 • 血清酶活力测定作为细胞和组织损伤的指标 • 治疗性药物监测成为临床生物化学的一个重要分 支 • 超微量的仪器分析、免疫学、分子生物学、放射 性同位素等技术在生物化学实验室中的应用 • 自动化装置和超微分析
临床生物化学
19世纪以来，随着医学科学的发展和实验室检测 需求的增加，一些化学家利用化学分析的手段实 现了对人类体液、血液某些生化指标的定量分析， 如血糖、尿素氮等，继之又逐渐建立了一些酶活 性的测定方法，这些利用化学手段建立的用于分 析患者体液、血液特定化学成分的方法对促进临 床医学由经验医学向现代医学转变起了巨大的促 进作用，逐渐形成了一门独立的学科—— 临床化 学(Clinical Chemistry)，国内习惯称此学科为 生化检验。此学科一直延续到今天，已发展壮大 为不可缺少的医学领域。
分类 • 电位法：测定原电池电动势以求物 质含量 • 电导法：测定电阻以求物质含量 • 电容量法：借助某些物理量的突变 作为滴定分析终点的指示
新兴技术
高效液相色谱分析法 毛细管电泳技术 生物芯片技术
高效液相色谱分析技术（HPLC)
高效液相色谱法是用特制微粒（＜10μm） 充填的层析柱作为固定相，通过高压使液 体流动相快速通过层析柱而达到快速有效 分离液相中各种物质的层析技术。它具有 分离效果好、分析速度快、检测灵敏度高 等特点。在医药卫生和生物化学领域得到 广泛的应用，蛋白质、糖类、核酸、氨基 酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及 高分子聚合物都能用HPLC测定。
与高效液相色谱法的比较
• 共同点：都是高效分离技术, 仪器操作均可自动 化, 且二者均有多种不同分离模式。 • 差异点： ⑴CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，CE的分 析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快； ⑵对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶 质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分 子而言, 其柱效就要比HPLC高得多； ⑶CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用 量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动 相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制 备, 而HPLC可作常量制备。