可抑制卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体

2.转基因动物培育方法
（1）显微注射法：大片段、应用广
流程：
目的DNA制备 DNA的注入原核胚
胚胎体外培养
胚胎移植（移植前鉴定）
发育
出生、鉴定
两种策略
1980年，Gordon等人首先育成 转生长素基因小鼠。 世界第一个转基因动物。 生长速度快2－4倍、体形大一
倍的转基因“硕鼠”。
的酶体系自行转录和复制，从而
可以使病毒单拷贝基因组稳定地 进入宿主细胞。
载体容量小（8KB）。
3. 乳腺生物反应器
（Mammary gland bioreactor）
将外源基因置于乳腺特异性调节 序列之下，使之在乳腺中表达， 然后通过回收乳汁获得重要价值 的生物活性蛋白的技术。
1987 年Gordon 等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠
转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞， 表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、 疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。 转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，
表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技
术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因 此过程复杂。
丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。除了有效的抑制受精卵的染色
体分离和原核的移动，6-DMAP会造成染色质分散从而使极体排放受阻 诱导出三倍体。 C 生物法 瑞齐（Rasch）等于1965首先证明了三倍体脊椎动物可通过四倍体个体 与二倍体个体杂交产生。
二、多倍体倍性的鉴定
人工诱导不能百分之百地成功诱导出多倍体，处理过的群体可能是由多 倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体，所以需 要鉴定染色体的倍性，从中筛选出需要的多倍体。 常用的多倍体倍性鉴定鉴定方法有用间接法（如核体积测量、形态学检 查等）和直接法（如染色体计数以及DNA含量测定等）两类。 （1）核体积测量法：一般而言，细胞核大小与染色体数目成比例，为了 维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因 此多倍体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。因此，通过体细胞核体 积的测定可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。
第九章 多倍体与转基因动物
本节主要内容： 1.多倍体动物育种
2. 转基因动物生物反应器——乳腺生物反应器 本节关键问题：
乳腺生物反应器制作大致流程。
第一节 多倍体动物
问题1：为什么动物的多倍体比植物少？ 植物： （1）大多数植物是雌雄同体或雌雄同花的，它们的精原细胞和卵原 细胞可能同时发生不正常的减数分裂，使配子中染色体数目不减半， 这种配子通过自体受精而自然形成了多倍体。 （2）植物的繁殖比较容易，如果多倍体植物不能形成种子，它还能 依靠营养器官的无性繁殖来产生后代，因此在生物进化过程中，植 物多倍体有可能被保存下来。 动物： （1）高等动物的远源杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体。 （2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡，因此 很难得到多倍体的子代个体。
（3）在家畜转基因技术方面，目前多用原核胚胎显微
注射，平均成功率比较低，需要大量的供体和受体动物。
谢 谢！
β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)基因及其调控序列。
乳白蛋白(α-lactalbumin ) 基因及其调控序列。
（3）鉴定
目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，
以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点 杂交(Dotbloting), Southern印迹分析等多种方法进行检测。 目的蛋白的鉴定：建立动物乳腺生物反应器的最终目的 是得到有活性的外源蛋白，因此，对目的蛋白的检测非常
DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要
专门仪器。
第二节 转基因动物生物反应器
一 、基因生物反应器
转基因技术（Transgenic technique）：通过人工方式将外源 基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能稳定地 将此基因遗传给后代的技术。 转基因生物反应器（Transgenic bioreactor）：将外源基因转
重要。检测方法主要有：
(1) SDS－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) (2) 酶联免疫吸附实验(ELISA) (3) Western印迹分析
遇到问题
（1）理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因在受体 动物基因组随机整合，遗传不稳定、表达率不高。 （2）异位表达和表达产物的泄漏问题，需要乳腺组织 特异性高效表达载体，保证外源基因在乳腺中专一表达。
但需专门的设备如水压机等，同时样品室容量有限，不适宜大规模
生产。此外，静水压处理还使染色体发生了不同程度的凝缩，导致染 色体在后来的发育过程中呈现不同的变化。静水压处理不当还可能使
受精卵的结构发生某些物理和化学变化，得到的子代不可避免地产生
轻微的染色体畸变造成发育受阻。由于上述原因加上处理时对设备的 要求生产中应用较少。
IV、VIII、纤维蛋白原、降钙素、SOD、红细胞生成素、 IGF-1等成功表达，多种药用蛋白已经进入临床试验阶段。
上海交通大学医学遗传研究所： 1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX蛋 白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。 1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛—“滔
一、 多倍体动物产生原理与诱导方法
1、产生原理
鱼类精子入卵的时期是第二 次减数分裂的中期，刺激卵 子继续完成第二次分裂。卵 中原有的二组染色体中一组 作为第二极体排出受精卵成 为正常的二倍体。如果在精 子入卵时第二极体不能正常 排出，则精卵原核结合成为 三倍体受精卵。 如果卵子受精后，照常排出 第二极体形成单倍体卵，单 倍的卵原核与单倍的精原核 结合就形成二倍的受精卵， 这时再抑制受精卵的第一次 卵裂，则产生四倍体。 产生原理：染色体的加倍可以通过保 留受精卵第二极体即抑制卵子的第二 次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵 裂来实现。
乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培
育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠.。 2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物 反应器生产的基因工程蛋白药物—重组人抗凝血酶Ⅲ （商品名：ATryn ）上市获得批准。
目前，α1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝血因子III、
B 化学法
细胞松弛素诱导法：细胞松弛素B(CB)导致极体的保留是通过阻止卵子 微丝环的收缩和极体的分离来实现的。CB处理比其他物理方法如温度、
水压等能更有效地诱导三倍体的形成。
6-甲氨基嘌呤诱导法： 6–DMAP 是一种蛋白激素酶抑制剂。当6– DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有
二、 转基因动物生物反应器
1.转基因动物（transgenic animal）：是指 在基因组内稳定地整合外源基因，并且外 源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程
动物。
利用转基因动物生产人类药用蛋白等非常 规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研 究的热点之一。
2.转基因动物培育方法
（1）显微注射法：大片段、应用广
（2）染色体计数法：将细胞固定制片、染色后观察染色体 个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目 前鉴定多倍体倍性的一种直观、准确的方法，缺点是比较
费时。
（3）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个 比较有效的直接鉴定方法。可以测定单个细胞的DNA含量， 再根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的 DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。
发表在1982年的nature杂志上。
（2）胚胎干细胞方法
胚胎干细胞（ES）是一 种含正常二倍染色体的
具有发育全能性的细胞，
因此只要将外源DNA导
入胚胎干细胞就可以实
现基因的转移。
（3）逆转录病毒法
逆转录病毒是一种整合型的单链
RNA病毒。 将目的基因重组到反转录病毒载
体上，感染胚胎。
病毒进入细胞后，利用宿主细胞
2、诱导方法
A 物理方法 机制主要是通过破坏微管形成，使由微管蛋白聚合
成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体失
去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形成
多倍体细胞。
（1）温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休
克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵
裂)的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休克法。 一般冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围为28℃-
入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动
植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。
转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅 速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的 大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化 获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药
物。
转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞， 表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目 前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度。
滔”降生。
（1）优点
1）生物学活性和功能与天然蛋白完全相同（经过充分的修
饰加工，具有稳定的生物活性）。
2）对动物的生理影响较小（乳腺是一个体外分泌器官，乳 汁不进入体内循环。 3）表达产量高、表达产物的提纯相对容易、生产成本相对 较低。
4)表达产品的安全性好。
（2）关键环节
使用合适的乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有效的乳腺组织特 异性表达载体。 目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基因及调控序列的 主要有： 乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。 酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。
36℃;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0℃左右。
通过温度调控技术诱导多倍体是物理方法中简便而效果佳的方
法之一。
（2）水静压法：采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制卵母细胞 第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。
静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝即纺锤体和星体，从而暂
时阻断了有丝分裂的进程。 该方法易于掌握，处理程序易于标准化，诱导率较高。