酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性

酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性
王华;黄宜兵;高科翔;孙辉;高忠礼
【摘要】利用一种工业用碱性蛋白酶对新鲜梅花鹿鹿茸进行水解,制备得到生物活性肽.首先,考察了酶用量、底物浓度和反应时间对水解反应的影响,确定了最佳水解条件为酶与底物质量比1:150,底物与溶剂质量比1:13,水解时间60 min.其次,利用硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液,同时采用缓冲液保护其活性,再经Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到了具有最强抗氧化活性的鹿茸肽组分(VAP-B).最后,利用制备型高效液相色谱柱对VAP-B进一步纯化,得到了分子量在800以内的小肽活性组分(VAP-B1),其蛋白含量为70.45%.在此基础上,对小肽活性组分VAP-B1进行了理化性质分析,检测其抗氧化活性,包括清除超氧阴离子、羟自由基以及抗脂质过氧化的能力和还原能力.实验结果表明,当鹿茸肽VAP-B1浓度为20 mg/mL时,对邻苯三酚自氧化的抑制率达到91.9%,有明显的清除超氧阴离子的作用;当浓度为10 mg/mL时,对羟基自由基的清除作用达到100%,且在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系.此外,鹿茸肽VAP-B1还具有一定的防止脂质过氧化和还原的作用.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2010(031)012
【总页数】6页(P2390-2395)
【关键词】鹿茸肽;碱性蛋白酶;酶解;抗氧化活性
【作者】王华;黄宜兵;高科翔;孙辉;高忠礼
【作者单位】吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,长春,130021;吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,长春,130033;吉林大学中日联谊医院,长春,130033
【正文语种】中文
【中图分类】O629;Q505
鹿茸取自梅花鹿(Cervua Nippon Temminck)尚未角化的幼角.《本草纲目》中记载，鹿茸能生精补髓，养血益阳，强筋键骨.鹿茸中含有多种生物活性物质，能够促进机体的生长发育和新陈代谢［1］，增强机体的免疫功能［2，3］，对神经系统和心血管系统具有良好的调节作用，对骨折及创伤愈合有促进作用［4～6］，它能在短期内迅速生长发育成具有成骨、造血、神经与表皮生长、生毛与血管发育的综合器官，说明鹿茸在骨化之前贮存了大量的生长因子［7］.临床上鹿茸被用于多种疾病的治疗，并取得了良好的效果.
陈书明等［8］报道，天然鹿茸醇提物可提高小鼠清除自由基的能力，增强小鼠的抗氧化作用.但关于梅花鹿鹿茸的酶解多肽是否具有抗氧化活性作用迄今尚未见报道.本文利用一种工业用碱性蛋白酶水解新鲜梅花鹿鹿茸，并通过正交试验对水解条件进行了优化，采用缓冲溶液保护鹿茸肽活性及硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液，依次经过离心、过滤、Sephadex G-25凝胶层析柱分离和制备型高效液相色谱柱纯化分离，得到一个分子量在800之内的小肽活性组分，并对其抗氧化性进行了详细的研究，为鹿茸深加工以及开发抗衰老的低分子量鹿茸肽药物提供了理论依据.
新鲜成年梅花鹿鹿茸(二杠)购自长春市双阳区鹿乡亨达鹿产品经销处;碱性蛋白酶Alcalase购自Novo-Nordisk公司(丹麦);HPLC级乙腈购自DIKMA公司(美国);亚油酸(Linoleic acid)购自Fluka公司，其它试剂均为国产化学纯.
UV2550型紫外分光光度仪及LC-6A制备型高效液相色谱(Shimadzu公司);HD-2000型紫外检测器(上海嘉鹏科技有限公司).
1.2.1 鹿茸的预处理参照文献［8］方法进行鹿茸的预处理.
1.2.2 鹿茸样品水分含量测定参照文献［9］报道的干重法测定样品中水分含量，水分(%)= G/W×100% ，其中G为样品干燥后失去的质量(g);W为样品质量(g).
1.2.3 鹿茸样品总氮含量测定采用微量凯氏定氮法［10］测定样品中总氮含量. 1.2.4 酶解正交试验设计利用正交实验确定酶解新鲜鹿茸的最佳工艺条件，选择酶浓度(A)，底物浓度(B)及时间(C)作为试验因子，采用L9(34)正交试验设计，水解效果以水解产物的抗氧化性为依据.实验选用碱性蛋白酶作为催化剂，与一般蛋白酶相比，碱性蛋白酶具有热稳性好、酶切位点多、价格便宜且用途广泛等优点. 1.2.5 酶解鹿茸蛋白水解度的计算酶解鹿茸蛋白的水解度(DH)可以根据消耗的碱量进行控制，即pH-stat法［11］.水解度的计算公式为
DH=VNaOH·1/α·cNaOH/Mp·1/htot.式中，VNaOH(mL)为水解过程中消耗的NaOH量;Mp(g)为蛋白总量;α为α-氨基的解离度，α=10pH－pK/(1+10pH－pK)，其中pK为α-氨基的pK值;cNaOH为摩尔浓度;htot为每克蛋白质中肽键的当量数，取为8.38.
1.2.6 鹿茸肽粗提液的制备取适量新鲜鹿茸，加入一定体积的水，用4 mol/L的NaOH溶液调节反应体系pH=8.0，于50℃恒温水浴振荡反应.将预先50℃保温的酶液加入到上述体系中，开始酶解反应.在反应过程中，通过补充0.5 mol/L的NaOH来维持反应体系pH值为8.0±0.1.根据加入的碱量计算水解度，预期水解度达到10%时，加入2 mol/L的HCl调节pH为4.0，于90℃保温10 min使酶灭活.终止反应，将水解液冷却至常温，于4℃下以10000 r/min高速离心浓缩20 min，减压抽滤过0.45 μm滤膜3次，收集滤液，即得鹿茸肽粗提液.
1.2.7 鹿茸肽粗提液的分离纯化 (1)硫酸铵分级沉淀［10］:对鹿茸肽粗提液采用硫
酸铵分级法进行初步分离.
(2)凝胶过滤层析:取鹿茸粗提液冻干品用Sephadex G-25凝胶过滤柱进行分离纯化，分别收集各洗脱峰，真空冷冻干燥.用于抗氧化活性试验筛选.
(3)制备型HPLC纯化:取适量Sephadex G-25凝胶过滤得到的抗氧化活性最强的组分，用制备型HPLC进一步纯化.收集样品，进行抗氧化对比实验.
采用Folin-酚法测定酶解鹿茸肽的蛋白含量［12］;氨基酸组成分析采用反相色谱分离方法进行［13］;分子量鉴定采用电喷雾质谱(1100 LC/MS)测定.
1.4.1 O2－自由基清除实验利用邻苯三酚(PR)自氧化法测定酶解鹿茸肽清除O2－自由基的抗氧化性［14～16］.酶解鹿茸肽对邻苯三酚自氧化抑制率采用下式计算:I(%)=(ΔA0－ΔA)/ΔA0×100%，其中I为抑制率，ΔA为加入肽液后邻苯三酚的自氧化速率，ΔA0为加入肽液前邻苯三酚自氧化速率，自氧化速率定义为每分钟光密度值的变化.
1.4.2 羟自由基清除实验采用Fe2+-H2O2-罗丹明分析体系检测酶解鹿茸肽对羟自由基清除能力［17］.鹿茸肽对羟自由基的清除率(D)的计算公式如下:D(%)=(As －A0)/(A－A0)×100%.式中As为加入一定量的抗氧化药后体系的吸光度，A0为未加抗氧化药的体系的吸光度，A为未加Fenton试剂及抗氧化药的体系的吸光度为.
1.4.3 脂质过氧化实验参照文献［18］中的硫氰酸铁法进行脂质过氧化实验.
1.4.4 还原力测定取0.25 mL鹿茸肽溶液，加入0.25 mL 0.2 mol/L pH=6.6的PBS缓冲液及0.25 mL 1%铁氰化钾，置于50℃水浴中20 min.取出冷却到室温后，加入0.25 mL 10%三氯乙酸(TCA).于4℃下，以3000 r/min转速离心10 min.取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸馏水及0.1 mL 0.1%三氯化铁溶液，反应10 min.在700 nm下测定其光吸收值，吸光值的高低表示样品的还原能力的强弱.
2.1.1 水分含量测定测定结果表明，新鲜梅花鹿鹿茸样品中水分含量为81.94%.
2.1.2 总氮量和蛋白含量测定微量凯氏定氮法测得鹿茸总氮量平均值为10.25%，鹿茸蛋白含量平均值为64.1%.
2.1.3 酶解鹿茸肽的分离和纯化在正交试验所确定的最佳酶解条件下制备得到的鹿茸肽粗提物为淡黄白色粉末.经Sephadex G-25凝胶色谱柱分离，共获得3个洗
脱峰(VAP-A，VAP-B和VAP-C)，经抗氧化实验检测发现，鹿茸多肽B(VAP-B)
组分的活性明显高于VAP-A和VAP-C组分.VAP-B组分冻干后，呈淡黄白色粉末状.将层析分离得到的VAP-B组分用制备型HPLC柱进行进一步的分离纯化.收集
各洗脱峰，进行抗氧化实验，结果发现，第一个洗脱峰(VAP-B1，保留时间为
2.182 min)活性较强.经透析、冻干后，得到的冻干品呈白色絮状干粉.
2.2.1 鹿茸多肽的双缩脲反应鹿茸多肽VAP-B和VAP-B1与双缩脲试剂反应体系
均呈现紫色，说明提取物中含有肽键，证明提取物是多肽或蛋白质类物质.
2.2.2 Folin-酚测定蛋白质含量 HPLC纯化得到的鹿茸肽干粉蛋白含量为
70.45%(质量分数).
2.2.3 鹿茸肽氨基酸组成鹿茸肽VAP-B1的氨基酸分析结果如表1所示.可见，甘
氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu)含量较高.
2.2.4 鹿茸肽的分子量对制备型HPLC纯化得到的鹿茸肽VAP-B1进行质谱分析，证实其为相对分子量小于800的小肽.
2.3.1 对O2－自由基清除作用氧阴离子自由基具有重要的生理作用，与多种疾病
的发生密切相关.氧阴离子自由基是所有氧自由基中的第一个自由基，可以经过一
系列反应生成其它氧自由基，因此对其进行检测具有特别重要的意义.邻苯三酚自
氧化法是检测O2－自由基的一种简便快捷的方法.邻苯三酚自氧化过程中产生O2－自由基，其自氧化产物在325 nm处有最大吸收.在抗氧化肽存在下，自氧化反
应受到抑制，自氧化产物生成量减少，可通过检测325 nm下的吸收来反映抗氧
化剂对邻苯三酚自氧化的抑制程度［14～16］.在本研究中，首先检测了鹿茸多肽
的抗氧化效果以及对氧自由基的清除效果.
实验中将鹿茸肽粗提取样品过Sephadex G-25凝胶柱后收集得到3个组分，其中第二个峰VAP-B为主峰，经进一步色谱分离纯化得到VAP-B1.VAP-B1对O2－自由基清除的效果显著，实验结果见表2.以O2－自由基清除实验结果作为评价标准，确定鹿茸肽正交水解实验结果最佳水解体系如下:酶与底物质量比1∶150，底物与溶剂质量比1∶13，水解时间90 min.考虑到60 min水解产物的抗氧化效果与90 min水解产物接近，为节约时间，后续实验采用60 min为水解时间.
利用优化的实验条件水解鹿茸多肽并进行纯化，研究其清除超氧阴离子的能力.以时间为横坐标，以325 nm下吸光度值为纵坐标做图，所得直线的斜率反映了邻苯三酚的自氧化速率(图1).研究发现，在0～20 mg/mL浓度范围内，鹿茸肽的抗氧化效果呈现明显的剂量依赖性，当鹿茸肽浓度为20 mg/mL时，对邻苯三酚自抑制率可达到91.9%，表明鹿茸肽有明显的清除超氧阴离子的作用.2.3.2 对羟自由基的清除作用羟自由基是已知的最强氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性强，是氧气的三电子还原产物，反应性极强，寿命极短，在水溶液中的寿命仅为10－6s.羟自由基几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害极大［19］.通过Fenton反应产生羟基自由基，加入显色剂罗丹明B，羟基自由基可以使罗丹明B 颜色减弱，通过在400～700 nm下测定其最大吸收波长，可间接测定羟基自由基的产生量.该法是一种简便的筛选抗氧化剂的方法［17］.同样，以分离纯化得到的水解产物VAP-B1为研究对象，研究其对羟基自由基的清除作用，结果如表3所示.最佳水解条件为酶与底物质量比1∶150，底物与溶剂质量比1∶13，时间为60 min.实验结果表明，VAP-B1对羟基自由基的清除作用达到100%，能完全清除羟基自由基.
2.3.3 抗脂质过氧化作用在生物体系中，细胞膜和细胞器膜中含有大量不饱和脂肪酸侧链，很容易引起脂质过氧化，而很多疾病及衰老现象均与脂质过氧化有关.实
验采用硫酸氰铁法检测了鹿茸肽的抗脂质过氧化能力.利用了脂类自由基的氧化性，可以将Fe2+氧化成Fe3+，形成硫酸氰铁化合物，利用其在一定波长吸光度值的
大小反映了脂质过氧化程度的强弱［18］.
鹿茸肽VAP-B1抗脂质过氧化作用的实验结果如图2所示，以维生素C为阳性对照，水为阴性对照，样品VAP-B1和维生素C的浓度均为10 mg/mL.可以看出，随着时间的增加，吸光度值都有不同程度的增大，其中阴性对照空白水的增幅最大，维生素C增幅最小，而鹿茸肽的曲线在两者之间，说明鹿茸肽VAP-B1具有一定
的防止脂质过氧化作用，但抗氧化能力不及Vc.
2.3.4 还原力试验样品的抗氧化作用与还原力关系密切，且吸光值越大，还原力越强.鹿茸肽还原力的测定结果如图3所示.可见，对于鹿茸肽样品而言，随着样品浓度的增大，其还原力也逐渐加强，当VAP-B1浓度为10 mg/mL时，其还原力可达到0.5左右，但明显低于对照品Vc的还原力0.8，说明鹿茸肽VAP-B1具有一
定的还原力，但其还原能力低于Vc.
通过酶解新鲜鹿茸获得的鹿茸多肽具有抗氧化活性，可清除体内过多的氧自由基以达到延缓衰老的作用.以抗氧化活性为指标，对酶解反应体系进行了正交优化，最
佳水解条件为酶与底物的质量比1∶150，底物与溶剂的质量比1∶13，水解时间60 min.水解提取物经过一系列的纯化分离，得到的小肽分子的分子量低于800，在清除超氧阴离子、羟自由基以及抗脂质过氧化方面都表现出一定的活性.这为进
一步深入研究鹿茸的抗氧化机理以及鹿茸的深加工及筛选，开发延缓衰老、耐缺氧和抗疲劳等鹿茸多肽药物提供了理论和实验依据.
KeywordsVelvet antlers peptide;Alcalse;Enzymatic hydrolysis;Antioxidative activity
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AbstractAn industrial alkaline protease alcalase was used to hydrolyze the fresh velvet antler of sika deer (Cervus Nippon Temminck).The conditions of enzymatic hydrolysis were optimized.The effects of several factors，including amount of the enzyme，substrate concentration and hydrolysis time，on the antioxidative activities of the hydrolysis product were examined by orthogonal test design.The optimum hydrolysis conditions were established to be the amount of enzyme，1∶150;the substrate concentration，1∶13;hydrolysis time，60 min.The crude velvet antlers peptides were prepared by fractionation of ammonium sulphate.An elution peak with high antioxidative activities from Sephadex G-25 column chromatography of the crude velvet antlers peptides was collected and named as VAP-B.Finally，a further purified velvet antlers peptide component(VAPB1)with molecular weight distribution from 200 to 800 was obtained from VAP-B by preparative HPLC.The protein content of VAP-B1was 70.45%.An analysis of amino acid composition was also carried out.The antioxidative activities of velvet antlers peptide component(VAP-B1)，including removal of superoxide anions，hydroxyl radicals and inhibition of lipid peroxidation were examined.The reducing power of VAP-B1was also tested.The experimental results indicated that when VAP-
B1concentration was 20 mg/mL，the inhibition ratio to pyrogallic acid autoxidation reached to 91.9%，having a strong ability to scavenge superoxide anion;when VAP-
B1concentration was 10 mg/mL，the clearance rate to hydroxyl radical was 100%and was dosagedependent in a certain rage of concentration.At the same time，VAP-B1showed some capability of inhibition of lipid peroxidation and reducing power.。