搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响

第54卷　第3期 化 工 学 报
Vol.54　№3
2003年3月 Journal　of　Chemical　Industry　and　Engineering　(China) March　2003研究论文搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响
高海军1,2　陈　坚2　堵国成2　章燕芳2　陈金春1　陈国强1
(1清华大学生物系,北京100084;2江南大学生物工程学院,江苏无锡214036) 摘　要　研究了透明质酸的流变学特性以及搅拌和混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响。

结果表明:透
明质酸溶液属于典型的非牛顿凯松流体;搅拌转速和透明质酸浓度对气液传氧速率有很大影响;在较高的搅拌
速率下发酵时可以得到较高的透明质酸产量,650r・min-1时透明质酸产量为411g・L-1,产率系数为0108g・
g-1;用有效搅拌模型分析发酵过程发现,只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态。

关键词　透明质酸　兽疫链球菌　流体　发酵　模型
中图分类号　TQ92011 文献标识码　A 文章编号　0438-1157(2003)03-0350-07 EFFECT OF AGITATION AN D MIXING ON H YAL URONIC
ACID PROD UCTION BY Streptococcus zooepidemicus
G AO H aijun1,2,CHEN Jian2,D U G uocheng2,ZHANG Yanfang2,
CHEN Jinchun1and CHEN G uoqiang1
(1Depart ment of Biological Science and Biotechnology,Tsinghua U niversity,Beijing100084,China;
2School of Biotechnology,Jiangnan U niversity,W uxi214036,Jiangsu,China)
Abstract　Rheological features of hyaluronic acid and effects of agitation and mixing on hyaluronic acid(HA) production by S t reptococcus zooepi dem icus were investigated.HA solution is a non2Newtonian Casson2fluid. Oxygen transfer rate between gas and liquid phase was influenced by agitation and concentration of HA.High HA production was accompanied by faster agitation.HA concentration and yield of HA at650r・min-1reached 411g・L-1,0108g・g-1respectively.Based on circular cylinder cavern model,culture system was in perfect mixing state only at high speed agitation.
K eyw ords　hyaluronic acid,S t reptococcus zooepi dem icus,fluid,culture,model
引　言
透明质酸(HA)是一种高分子量的黏多糖,由UDP/葡萄糖醛酸和UDP/N2氨基葡萄糖为单体交替连接而成[1],几乎存在于所有高等生物的软组织中,特别是在滑液和眼球的玻璃体中,具有重要的生理功能[2].在微生物特别是链球菌中HA以荚膜的形式出现.由于其结构特点,HA溶液具有极高的黏弹性和持水性,已广泛应用于化妆品、伤口愈合剂、滴眼液以及眼科、关节手术的制剂等[3],同时HA衍生物制备与应用方面的研究也在不断展开[4].虽然HA首先是从牛眼玻璃体中提取的,但A、C族链球菌荚膜中的HA与哺乳动物结缔组织中的HA没有区别.
由于传统的动物组织提取法生产HA有许多难以克服的缺点,原料缺乏,成本很高,易受污染,同时HA市场不断扩大,微生物发酵法生产HA于1983年开发成功[5].此后关于HA生产的研究主要集中到用C族链球菌进行发酵生产上,研究内容包括基本发酵工艺[6,7]、营养要求[8,9]、发酵条件的
2001-09-17收到初稿,2001-12-20收到修改稿.
联系人:陈国强.第一作者:高海军,男,33岁,博士,助理研究员.
R eceived d ate:2001-09-17.
Corresponding author:CHEN Guoqiang.E-m ail:chengq@
优化[10]等,但尚未见到关于HA发酵液的流体状态与发酵的关系等较为深入的研究报道.
本研究考察了HA溶液的流变特征,研究比较了不同条件下HA溶液的混合与传氧,考察了搅拌与混合对HA发酵生产的影响,并用有效搅拌模型对发酵体系进行较为深入的探讨.
1　材料和方法
111　菌　种
实验菌种为C族的兽疫链球菌(S t reptococcus zooepi dem icus)H23(实验室保藏号).
112　培养基
斜面、种子、发酵培养基见参考文献[11]. 113　培养方法
斜面与种子培养方法见参考文献[11].
小型发酵罐培养:215L发酵罐(韩国KFC),配有单只圆盘透平桨,桨、罐直径比D/T=1/2.加入115L发酵培养基,于121℃下灭菌15min.接种量为10%(体积),发酵过程中采用5mol・L-1 NaOH溶液自动控制p H值为710±011,培养温度为37℃;初始葡萄糖浓度为50g・L-1,通气量为3L・min-1,搅拌转速文中具体给出.
114　测定方法
透明质酸含量测定:采用Bitter-Muir氏法[12].
葡萄糖含量测定:采用3,5-二硝基水杨酸法[13].
菌体量测定:采取干重法与比浊法对照.将发酵液(适当稀释)离心后取沉淀,去离子水洗涤,于80℃干燥24h后,称取细胞量,计算细胞浓度;或悬浮于一定体积的去离子水中,于620nm比浊,与标准曲线对照,计算细胞浓度.
HA分子量测定:极限黏度法[14].
乳酸含量测定:对羟基联苯法[15].
体积传氧系数(K L a)测定:溶氧电极(M ETTL ER TOL EDO,Switzerland)法[16].
流体黏度测定:采用Haake旋转式黏度计(Haake viscometor,R otovisco R12,Haake MessT echik G mbh,G erman)测量,NV系统,温度为37℃,转速范围为0～256r・min-1.
2　结果和讨论
211　HA溶液的流变学特性与传质性能
21111　不同浓度HA溶液的流变模型　考察不同浓度HA溶液的流变学特性,结果如图1、图2所示.可以看出,随着剪切速率(γ・)增高,剪应力(τ)和表观黏度(η)的变化经历了两个阶段:在较低的剪切速率下,剪应力随剪切速率线性变化,而黏度为常数,这个剪切速率范围比较小,并且浓度越高范围越小;继续增加剪切速率,进入另一个阶段,表观黏度迅速下降,出现明显的剪切变稀现象.可以看出浓度为0102～5g・L-1时的HA溶液在第1阶段(低剪切速率)内属于牛顿型流体,在第2阶段内具有非牛顿流体特性.Fouissac等[17]在25℃时研究HA溶液的流变特性,发现浓度为0111～11147g・L-1HA溶液的增比黏度ηsp也表现出同样的现象.高分子物质的稀溶液、浓溶液和亚浓溶液,其溶质与溶剂的作用形式不同,形成了不同的流变特性[18]
.
Fig11　Correlation of shear rate with shear stress
in HA solution at different
concentrations
Fig12　Correlation of shear rate with apparent viscosity in HA solution at different concentrations
将所测数据采用幂次定律模型(power law model)、凯松模型(Casson model)等进行拟合,结果如表1所示.可以看出,两种模型都能对数据进行较好的拟合,但根据对发酵过程和模拟体系的观察,当体系的HA浓度较高时,发酵罐中存在明显的停滞区(近罐壁处或上部),表明流体有屈服力存
・
1
5
3
・
　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响
T able 1　Rheological model of HA solution in different concentrations
HA/g ・L -1
Power law model Model
Regression coefficient
Casson model
Model
Regression coefficient
510τ=0198 γ0151
019934τ1
2=2146+01107 γ1
2019842410τ=1100 γ0146019773τ1
2=2146+01079 γ1
2019596310τ=0160 γ0149019847τ1
2=2100+01069 γ1
2019728215τ=0173 γ0153019913τ1
2=1191+01056 γ1
2019867110τ=0173 γ0133019760τ1
2=1162+01033 γ1
2019992011τ=0165 γ0132019734τ1
2=1148+01031 γ1
20197450102
τ=0154
γ0133019695
τ1
2=1131+01031 γ1
2019713
在.由于幂次定律模型中不含有屈服应力项(τ0),
而凯松模型中有屈服应力常数项,所以后者更为准确地描述了体系的流变学行为.21112　HA 发酵体系的混合与体积传氧系数(K L a )　氧传递速率常是生物反应系统的一个限制性因素,同时也是反应器放大的一个重要参数.发酵体系(包括非牛顿体系)的传氧效率的研究较多[19],但还未见有关HA 发酵液传氧性能的报道.图3、图4为不同搅拌转速和不同HA 浓度时模拟体系中的体积传氧系数.从图3可以看出,搅拌速率越高越有利于K L a 提高,并且两者几乎成线性关系.除有益于传质外,发酵过程中,高搅拌速率还可以保证细胞均匀悬浮,将其他营养物质混合均匀,驱散细胞周围由自身代谢产生的有害物质.从图4可以看出,HA 浓度对传氧效率也有很大影响.由前面的研究可以知道,HA 浓度增高,溶液的黏度迅速增大.高的液体黏度既增加气液传质界面阻力,又影响气体在溶液中的扩散.有研究指出小分子溶质在低分子溶剂中的扩散系数与溶剂的黏度成反比关系[20]
.
Fig 13　G as/liquid volumetric oxygen transfer coefficients with 319g ・L
-1
HA solution
under different agitation
speeds
Fig 14　G as/liquid volumetric oxygen transfer coefficients of HA solution with different concentrations
under agitation speed of 650r ・min -1
212　搅拌转速对HA 发酵过程的影响
对于HA 发酵,搅拌在发酵过程中有两个作
用:一为搅拌混合作用,强化气液间的氧的传递,既维持发酵液中有足够的溶氧,为细胞提供氧气,又可使发酵液中的各营养基质混合均匀,有利细胞的吸收和利用;另一为剪切作用,既影响细胞的生长,又可加速细胞荚膜从细胞表面脱离[7],从而影响HA 丝状大分子的分子量.这些作用共同形成了独特的HA 发酵特征.21211　搅拌转速对细胞生长的影响　发酵条件对发酵的影响首先表现在对菌体生长的影响上.图5为不同转速下菌体量随时间变化曲线,可以看出搅拌转速越高菌体生长速率越快,850r ・min -1时菌体量增加速率最快,最终菌体量也最大,达317g ・L -1,300r ・min -1时菌体量最低,仅为118g ・L -1,但整个发酵周期都在16h 左右.图6为菌体对碳源的产率系数(Y X )随搅拌转速变化曲线,可以看
出在高搅拌转速下Y X 也较高,300r ・min -1时为01032g ・g -1,而850r ・min -1时却达0107g ・g -1.
发酵法生产多糖时,随着发酵过程的进行,细
胞量增加,进入对数生长期后耗氧量急剧上升,产
・
253・ 化 工 学 报 2003年3月　
Fig 15　Time course of cell growth under different agitation
speeds
Fig 16　E ffect of agitation on cell yield
物浓度不断增加,发酵液黏度也逐渐增高,因而K L a 值迅速降低,当发酵进行到一定程度后,发酵液中的溶氧浓度(DO T )几乎为0(图7),此时溶液中的供氧与耗氧处于平衡状态
.
Fig 17　Time course of DO T in fermentation
process
Fig 18　Trend of DO T under interrupting oxygen supply
图7为典型的发酵过程DO T 变化图,可以看
出发酵过程中有相当一部分时间是处于DO T 为0或接近0的状态,搅拌转速不同时这个阶段的长短不同.图8为发酵过程中停止供气后发酵体系DO T 的变化,可以看出当DO T 低于10%以后细胞代谢速率减慢,呼吸强度降低.可以认为10%即为细胞生长的临界DO T [20].而高的搅拌转速使发酵过程处在较高的DO T 下,从而表现出较高搅拌转速有利于菌体生长.但高DO T 并不意味着可以获得高的HA 产量,这还存在着氧对部分途径的抑制、氧中间代谢产物(如O -2,H 2O 2)的毒害等作用[21].21212　搅拌转速对产物合成的影响
(1)搅拌转速对HA 产量和HA 产率系数的影响　研究生产条件对发酵的影响最主要的目的是提高产品的最终浓度(产量)以及底物对产物的产率系数.图9为HA 产量在不同搅拌转速下随时间的变化趋势图,图10为搅拌转速对HA 终产量及产率系数(Y HA )的影响.可以看出,HA 发酵初期合成速率较慢,当发酵进行到7～8h 后,HA 迅速增加,这个时期约占发酵期的50%.发酵后期,碳源浓度比较低时,菌体可以继续生长(图5中14～16h ),HA 则停止合成.在较低转速时HA 终产量随搅拌转速增加而提高,从300r ・min -1的218g ・L -1增加到650r ・min -1的411g ・L -1,但继续提高转速到850r ・min -1时产量迅速降低,仅216g ・L -1.Johns 等[7]也发现HA 产量在一定范围内随搅拌速率的增加而提高.300～650r ・min -1搅拌转速下Y HA 与Y X 变化趋势相一致,从01055g ・g -1升高至01080g ・g -1,而搅拌转速为850r ・min -1时则大为下降,仅为01051g ・g -1.
图9表明对于HA 发酵过程存在一个最佳搅拌转速,作者认为这可能有两方面的原因:一为前面提到的搅拌有助于HA 荚膜脱落,促进营养物质的吸收利用;另一为氧对菌体细胞的毒害作用.Cleary 和Larkin [22]对几株A 族链球菌研究后认为HA 荚膜多糖是防止氧对细胞毒害的保护膜,由于搅拌加速了氧的溶解,增加了细胞与氧的接触,从而也加速了细胞荚膜的合成以抵抗氧的毒害作用,而当搅拌转速超出了一定的限度时,细胞对氧过量摄入,则表现出氧对细胞的毒害作用,而使HA 产量大为降低.
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353・　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响
Fig 19　E ffects of agitation on HA
production
Fig 110　HA yield on glucose under different agitation speeds
(2)搅拌转速对相对分子质量(M η)的影响　HA 作为一种高分子黏多糖,分子量是影响其黏弹
,在发酵生产中HA 的M η同样也是应考虑的一个主要生产指标.从图11可以看出,在发酵初期,HA 分子量较低,随着发酵的进行,分子量不断提高,发酵终了时M η也达到最大.HA 的最终M η则随搅拌速率的提高而不断下降,300r ・min -1
时为211×106
,升高至850r ・min -1时则降至114×106.这与K im 等[10]所观察到的结果一致,但Armstrong 和Johns [23]却发现在300～1000r ・min
-1范围内搅拌转速对分子量没有
大的影响
.
Fig 111　Time course of relative molecular mass under
different agitation speeds
Van de Rijn 等[24]发现HA 是由HA 合成酶在
细胞膜上合成并分泌到胞外的.由于搅拌的剪切作
用,一方面可能引起HA 的非正常合成,使得正在
链延长阶段的HA 分子提前脱落,未达到一定分子量的HA ;另一方面,由于HA 是丝状长链分子,在搅拌剪切力作用下可能会发生断裂,从而降低了产品的分子量.
21213　搅拌转速对乳酸产量和乳酸产率系数的影
响　乳酸是HA 发酵过程中另一种主要产物,对其进行考察有助于了解菌种的代谢、发酵机制,以便创造条件使底物朝着有利于HA 合成的方向进行.图12为不同搅拌转速下乳酸的产量及产率系数(Y LA ).可以看出,在不同搅拌转速的发酵过程中大部分碳源转化成乳酸,搅拌转速越低表现越明显,300r ・min -1时乳酸量4612g ・L -1、产率系数0192g ・g -1,到850r ・min -1时乳酸产量4110g ・L -1、产率系数0181g ・g -1.合成乳酸是许多链球菌的特征,关于链球菌合成HA 的过程中伴随着乳
酸的大量产生已有许多报道[7,10].
Fig 112　E ffect of agitation on lactic acid production
21214　搅拌转速对HA 和乳酸比生成速率的影响
　图13为HA 发酵过程中产物的最大比生成速率
随搅拌速率变化关系图(图中数据系单位时间内产物平均比合成速率比较所得).可以看出,HA 最大比生成速率(πHA ,max )和乳酸的最大比生成速率(πLA ,max )变化规律略有不同.对于HA ,在300r ・min -1时πHA 最小,仅0111g ・g -1・h -1,转速在450～650r ・min -1范围变化时发酵具有最大的比生
成速率,πHA ,max =0122g ・g -1・h -1,继续增高转速,πHA ,max 开始下降,850r ・min -1时降为0117g ・g -1・h -1;对于乳酸,随搅拌转速的增加,其比合
成速率呈单一的下降趋势,300r ・min -1时为311g ・g -1・h -1,850r ・min -1时为212g ・g -1・h -1.较低转速时速率降低较快,较高转速时趋于平缓.213　HA 发酵过程中的搅拌效率
通常,高黏度假塑性发酵液的搅拌比较困难,
・
453・ 化 工 学 报 2003年3月　
Fig113　Maximum specific synthetic rate under
different agitation speeds
由于黏度梯度的原因使得远离搅拌器的流体流动性急剧下降,同时黏度也使搅拌器的泵送能力(pumping capacity)下降,导致搅拌死角的存在,使得混合效率下降,气体在反应器中难以被打碎成细小气泡.
前已述及HA溶液存在着一定的屈服力,当流体存在屈服力时,还可能产生一种“有效搅拌区域”(cavern volume)现象[25],即在搅拌器附近的圆柱形区域搅拌良好,而外围部分静止不动.在HA发酵过程后期,可以观察到体系中明显存在着这种现象.许多多糖的发酵体系中存在有效搅拌现象,Solomon等[26]、Nienow和Elson[25]等对羧甲基纤维素(CMC)、黄原胶等多糖溶液进行了较为深入的研究,发现搅拌器的大小、搅拌转速等都对有效搅拌体积有很大的影响,并提出了有效搅拌圆柱模型(circular cylinder cavern model).图14为搅拌转速和搅拌器直径对有效搅拌体积的影响[27]及圆柱有效搅拌模型.式(1)为有效搅拌模型中有效搅拌直径的数学表达式
D c D 3
=
1136
π2
P0ρN2D2
τ
(1)
式中　D c为有效搅拌直径,P0为不通气时的搅拌功率[28,29],ρ为发酵液体密度,N为搅拌转速, D为搅拌器直径,τ为表观剪应力(其值参见图1).当有效搅拌区域没有达到罐壁时其高径比为014,当区域达到罐壁后D c即为定值D f(罐径),区域高度随着搅拌速率增高继续增大.这里本文继续采用014作为高径比,而D c仅表示理论有效直径.
图15为HA发酵过程采用凯松模型和方程(1)进行计算后得到的有效搅拌体积(T c)占发酵体积(T v)的百分比随时间变化关系图.可以看出,高搅拌转速(650r
・min-1)时,整个过程的整个发酵体
Fig114　E ffect of agitation speed,diameter of impeller
on cavern volume and picture of circular
cylinder cavern model
Fig115　Time course of percentage of cavern volume to broth volume in culture process at
different agitation speed
・
5
5
3
・
　第54卷第3期 高海军等:搅拌与混合对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响
系都处于良好的搅拌状态,最终HA 浓度为411g ・L -1;而低搅拌转速时,随着发酵的进行有效搅拌体积逐渐减小,HA 合成量也相应减少(图9、图10),450r ・min -1、300r ・min -1时最终HA 浓度分别为317g ・L -1、218g ・L -1.可以推测混合是否完全、是否有大量非有效搅拌区域与HA 产量的高低有着密切的关系.Serrano 2Carreon 等[30]根据混合现象和动力学的相互作用提出了包含搅拌因子的黄原胶发酵的动力学模型,并对黄原胶发酵过程做出了很好的预测.R eferences
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